pH值影响细菌内毒素测定的实验室研究

【摘 要】目的：对pH值对细菌内毒素测定所产生的具体影响进行测定。方法：研究人员选择使用动态浊度法，来测量指定样品中内毒素含量；按照参考标准将样品细菌内毒素分为两种不同浓度的稀释液，然后利用14个pH值级，再与两种不同的鲎试剂进行化学反应，对两组回收率进行对比。结果：pH值梯度上，两种不同类型的鲎试剂都有出现了三个反应高峰，第一个高峰pH值为5.20；第二高峰pH值为7.83以及6.23；第三个高峰pH值为10.55。样品pH值位于6-8之间时，结果呈现出稳定状态。4λ阳性对照各自的回收率平均达到76.5%～115.9%、85.8%～99.8%，但是当样品pH值不大于3，或者不小于12时，细菌内毒素在实验过程中受到了明显的抑制，因此回收率并不高，平均≤56.8%。结论：在进行细菌内毒素实验的过程中，研究人员应该对检品pH值进行适当的调节，在应用是TAL鲎试剂时，实验检品pH值调节到6.5-7.5之间效果做好，而在使用LAL鲎试剂时，试验检品的PH值应该调节到6.1-6.3或者6.7―7.8之间效果最佳。

【关键词】pH值；细菌内毒素；鲎试剂

制药产业中，细菌内毒素是公认的药品热源本质。革兰阴性菌细胞壁中存在着大量的细菌内毒素，但是主要当细菌完全的处于死亡状态，发生裂解，细菌内毒素才会释放出来。细菌内毒素主要是由磷脂、多糖等成分构成，最为重要的成分是脂多糖。其能够导致发热、内毒素休克等病症。目前其已经是被用来替代家兔来进行热源试验，有很多国家的药典对此已经给予收载。中国药典规定只能够应用凝胶法来对细菌内毒素的含量进行测定。本文应用动态浊度法，对样品中所含有的细菌内毒素的含量进行测定，同时选择应用不同的鲎试剂，一种是TAL鲎试剂，另一种是LAL鲎试剂，以此来明确pH值对内毒素测量具有所产生的影响。

一、材料与方法

1、试剂和仪器

美国药典细菌内毒素参考标准品（RSE），10000EU・瓶-1；TAL（厦门鲎试剂厂，批号960118，灵敏度0.125EU・ml-1，1ml・瓶-1；LAL（美国Biowhittaker公司，批号5L0960，灵敏度0.125EU・ml-1，5.2ml・瓶-1；LAL溶解水批号4M0757，内毒素含量≤0.005EU・ml-1，pH6.23）；BET-32细菌内毒素测定仪（天津大学无线电厂）；206型pH计（上海雷磁仪器厂）；超净工作台（苏州净化设备厂）。

2、样品处理

氢氧化钠（AR）经185℃，4h烘烤，配制成饱和溶液。浓盐酸（AR）不经处理。按中国药典附录XVF方法，配制成0.1mol・L-1的NaOH和HCl溶液，121℃灭菌3h。配制中所用器材都除热原。用新鲜灭菌注射用水（WFI，pH5.61，内毒素含量0.03EU・ml-1）作稀释液。0.1mol・L-1盐酸连续4次10倍量稀释，0.1mol・L-1NaOH溶液连续6次10倍量稀释，并采用LAL溶解水（pH6.23）和WFI（pH5.61）制成14个量级的梯度pH溶液，分别加入RSE制成含细菌内毒素0.5EU・ml-1和0.125EU・ml-1的样品。

3、测定原理和方法

一定量的细菌内毒素和鲎试剂在37℃孵化时，混合物的浊度随时间而变化，在反应进行一半（t50）时，混合物浊度的变化速率最快。细菌内毒素测定仪可自动测定各浓度值下的t50，经分析计算后绘制标准曲线。阴性对照、阳性对照、空白对照同时立时，测定结果有效。异常值的舍弃依据Smirmoffsl法（n=4，α0.01=1.493）。

二、结果

1、试验分成3组，每组有14个样品，其pH递增。第1组加样品0.2ml（含0.5EU・ml-1RSE）和TAL0.1ml，该样品中RSE浓度为4λ。第2组加样品0.2ml（含0.5EU・ml-1RSE）和LAL0.1ml。第3组加样品0.2ml（含0.125EU・ml-1RSE）和LAL0.1ml，该样品中RSE浓度也为4λ。根据各样品的t50，。pH在4～11之间，RSD为1.16%～12.29%，s为0.0050～0.0546，实验的精密度较好。本实验结果发现，两种鲎试剂（TAL，LAL）在pH5.20，pH7.83/pH6.23和pH10.55处均有凝集高峰，当pH≤3或pH≥12时，细菌内毒素试验受到明显抑制（平均回收率≤56.8%）。两种鲎试剂在pH梯度上的回收有差别，但在pH6～8间，回收曲线稳定。

2、以pH梯度为横轴，绘制质控图。图1中可见几何平均值（x）、最大值和最小值，可同时观察试验的准确度和精密度。依据FDA规定，4λ阳性对照的回收应在标准曲线±25%以内，此处判断动态浊度法检验有效的标准是平均回收率达到（100±20）%，相应的警戒线为（100±10.7）%。因此，对TAL允许测量值为（0.5±0.1）EU・ml-1，警戒值为（0.5±0.0533）EU・ml-1，。最终结果显示：TAL实验的最佳pH为6.68～7.12，此时准确度和精密度较为满意，在pH6.23和pH7.83均有测量值逸出允许范围。对LAL允许测量值为（0.125±0.025）EU・ml-1，警戒值为（0.125±0.0133）EU・ml-1，。实验显示，LAL实验的pH值在6～8都满足试验的要求，在pH6.23处，反应可取得较佳回收，在pH6.68～7.83时，回收较为稳定。

图1 TAL检测4λ阳性对照的质控图

3、反应结束后（t>4200s），用pH试纸测定反应混合物pH值，结果见表1

表1反应结束时混合物PH值测定结果

三、讨论

1、后血细胞溶解物中存在大量的凝固酶原，而这些凝固酶原与细菌内毒素进行反应，形成凝固醇，再经过一系列的反应，生成凝胶样物质。在此反应中，凝胶生成速度与内毒素浓度两者呈正比例关系，除此之外，还受到温度、反应物、PH值的影响。PH值的高低对蛋白质活性有着重要的影响，尤其是对可凝蛋白生成凝胶有着非常大影响，最终影响了结果。

2、在该实验中，有关指定样品的PH值，美国与英国药典对此都做出规定，美国药典将PH值规定为6-8，而英国则规定为6.5-7.5。我国1995年药典对此并未做出相应规定。，目前国内外大量的文献记载应用的PH值有6-7.5、6.25-7.25、6-7等。但是这些结论大多数都是利用凝胶强度来进行实验，主观性比较强，国内有关文献认为如果应用大输液进行试验，可以不必对其PH值进行调节，但是通过此次试验，我们知道有效的PH值很有必要。即便样品的PH值已经处于6-8之间，但是实验过程中依然会受到其他影响的因素，因此每次实验都应该调节PH值。尽可能将其与标准曲线时所应用的PH值相同。

3、本研究中所使用动态浊度法以及相关的仪器设备都已经经过了检验。本次研究中样品总含量为0.2ml，鲎试剂反应含量为0.1ml。样品使用量要明显的高于凝胶法，所以应用这两种测试方法，最终试验结果可能会不一致，通过实验表明，鲎试剂自身拥有缓冲能力。当样品的PH值位于5.20―9.17之间时，PH值试纸反映出来的数值大体上是7。在这个范围内，动态浊度法仍显示了不同pH对测定结果有较大影响，其原因可能是混合物最终pH的细微差异会较大程度地影响凝胶的形成，但也不排除样品pH对鲎试剂中活性成分的影响，从这个角度讲，在pH问题上，两种测试方法是一致的。

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