对实验性肾脏病动物模型的再认识

[摘要] 肾脏病动物模型一般分为二类，一类是通过施加人为操作而模拟人类肾脏病的模型，这类经典的动物模型包括抗肾小球基底膜抗体肾炎、Heymann肾炎、抗Thy11抗体肾炎、BSA肾炎以及嘌呤霉素肾病等；另一类动物模型是“自然发病模型”，也就是让动物自然出现近似人类肾脏病的病理特征，它们包括HIGA小鼠IgA肾病和NZB/WF1小鼠、MRL/1pr小鼠狼疮性肾炎模型。另外，借助基因敲除、siRNA转染等现代分子生物学技术也可以制作出转基因动物模型。对于肾脏病领域的中药药效学、药理学研究而言，首要的是，正确认识各种肾脏病动物模型的特点，针对实验的具体目的而选择合适的模型；其次的是，需要病证结合动物模型的支撑。因此，建立具有中医证候特征的肾脏病动物模型是今后的发展方向。

[关键词] 肾脏病；动物模型

1900年，Lindemann用豚鼠抗兔肾抗体给兔注射而研制出世界上第一个伴有蛋白尿的抗血清肾炎动物模型[1]。此后的100多年来，用于了解人类肾脏病病因和发病机制的动物模型一般分为2类，一类是通过施加人为操作而模拟人类肾脏病的模型，这类经典的动物模型包括抗肾小球基底膜抗体肾炎、Heymann肾炎、抗Thy11抗体肾炎、BSA肾炎以及嘌呤霉素肾病等。其中，抗肾小球基底膜抗体肾炎是由针对肾小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）的外源性抗体所引发的，可以说，百年以来有关肾小球肾炎免疫发病机制的基础研究起始于该模型[2]。另一类动物模型是“自然发病模型”，也就是让动物自然出现近似人类肾脏病的病理特征，它们包括HIGA小鼠IgA肾病和NZB/WF1小鼠、MRL/1pr小鼠狼疮性肾炎模型。另外，借助基因敲除、siRNA转染等现代分子生物学技术也可以制作出抗肾小球基底膜抗体肾炎和狼疮性肾炎模型，也就是转基因动物模型（模式动物）[3]。从理论上说，相比于“人为操作”的动物模型，模式动物能更准确地模拟人类肾脏病的发病因素。

1 抗肾小球基底膜抗体肾炎模型――马杉肾炎

人类肺出血肾炎综合征（Goodpasture′s syndrome）临床表现为咳嗽、咳血、呼吸困难，并且，伴随着蛋白尿、血尿以及急剧的肾功能减退。这种疾病的肾损伤就是指患者出现抗肾小球基底膜抗体肾炎（anti-glomerular basement membrane nephritis）。患者肾小球内出现局灶增殖性病变和特征性IgG荧光抗体线性沉着，同时，鲍曼氏囊内充满了新月体。究其病因，就是因为机体产生了针对IV型胶原α3端NC-1区域的自身抗体[4]。

1931年，日本千叶大学病理学者“杉三”把含有无数抗原的大鼠肾组织匀浆给异种动物兔进行免疫，研制出“马杉肾炎（masugi nephritis）”模型[5]，该模型被欧美人称之为“肾毒素血清肾炎（nephrotoxin serum nephritis）”[6]，后来，因为发现该模型的致病性抗原在GBM上，所以，马杉肾炎模型成为后世研究人类抗GBM抗体肾炎的代表。近年来，日本学者永松等将大鼠肾皮质匀浆给兔子皮下注射，再用胰蛋白酶处理实验兔GBM而溶解其抗原，然后，把针对这种抗原的抗血清给大鼠静脉注射，致敏性兔球蛋白可以诱导大鼠出现严重的增殖性肾小球肾炎，称之为“新月体型抗GBM肾炎”。作者发现，给大鼠注射的抗GBM抗体会立即沉着于GBM，产生所谓“异源性阶段（heterologous phase）”的免疫反应而损伤GBM，此后，在实验鼠体内产生能与GBM结合的抗兔IgG抗体，该抗体在GBM上诱发了第2次“同源性阶段（autologous phase）”的免疫反应。此时，再次静脉注射兔致敏性球蛋白（抗GBM抗体）可直接引发“同源性阶段”的免疫反应而诱导肾炎[7]。抗GBM抗体肾炎就是基于这样的免疫反应原理而发生的。与马杉肾炎相比，该肾炎模型在肾小球内形成了明显的新月体，肾功能急速下降，与人类激进性肾小球肾炎的肾组织病变特征非常类似。借助这个动物模型可以观察激素、免疫抑制剂以及抗免疫性中药治疗肾炎的药效。

近年来，借助磁性微粒子和磁石的肾小球分离术可以制作出高特异性的抗小鼠GBM抗体[8]。此外，各种转基因抗GBM抗体肾炎小鼠模型也孕育而生，其中，包括敲除前列腺素E2受体亚型 EP1的转基因小鼠模型[9]，还有瘦素缺损性转基因小鼠模型[10]，这些模式动物可用于研究抗GBM抗体肾炎进展的机制。

2 膜性肾病模型――Heymann肾炎

迄今为止，人类膜性肾病（membranous nephropathy，MN）致病性抗原还不是很清楚，可能与疟疾、B型肝炎、梅毒等感染有关。该病的临床表现是伴有大量蛋白尿、低蛋白血症的肾病综合征。其病理特征包括GBM上皮细胞侧出现免疫复合物沉淀（光镜）、肾小球毛细血管网呈结节状改变（光镜）、GBM肥厚（电镜）以及上皮下致密沉积物（电镜）等[11]。

1959年，Heymann等将大鼠的肾组织匀浆直接给同种大鼠免疫而诱导实验鼠出现蛋白尿，称之为“Heymann肾炎（Heymann nephritis）”。其中，用大鼠肾小管刷状缘蛋白和免疫增强剂共同免疫正常大鼠而获得的模型称之为“主动型Heymann肾炎（active Heymann nephritis）”模型；由大鼠肾小管刷状缘蛋白免疫异种动物而得到的抗体再免疫正常大鼠，这样的模型称之为“被动型Heymann肾炎（passive Heymann nephritis）”模型[12-13]。此后，分离模型鼠肾小管刷状缘，提纯蛋白而知其抗原为Fx1A，将Fx1A给兔免疫而获得抗血清，再把这种抗血清经静脉给大鼠注射，实验鼠便出现蛋白尿，同时，在实验鼠GBM上皮下形成了免疫复合物（immune complex），这一发现促使了“人类肾炎局灶性免疫复合物形成理论”的诞生[14]。Farqure等针对Fx1A进行抗原研究，逐步发现Heymann肾炎致病性抗原是gp300糖蛋白，即肾小管上皮细胞内的清道夫受体“megalin”[15-16]。人类膜性肾病的病理特征Heymann肾炎模型中都能得到很好的体现。据报道[13]，将Heymann肾炎模型鼠肾组织进行免疫荧光染色，可见颗粒状荧光在肾小球呈串珠状表达，这与人类膜性肾病的特征极为相似。有关Heymann肾炎模型的研究有助于深入了解人类膜性肾病的发病机制。另外，刘志红院士团队借助被动型Heymann肾炎模型阐明单味中药雷公藤主要成分――雷公藤甲素（triptolide）通过保护C5b-9介导的足细胞损伤而减少蛋白尿的机制[17]。

3 系膜增殖性肾小球肾炎模型――抗Thy11抗体肾炎

国际上普遍采用抗Thy11抗体诱导的肾炎模型研究人类系膜增殖性肾小球肾炎（mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN）的发病机制[18]。日本学者Ishizaki等发现大鼠肾小球系膜细胞存在Thy11抗原（胸腺抗原），用抗胸腺细胞抗体免疫大鼠可诱导出系膜增生性肾小球肾炎[19]。此后，出现了抗Thy11单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb），包括“mAb OX-7”或“mAb 1-22-3”等。

日本学者研制的mAb 1-22-3（IgG3）来源于BALB/c小鼠胸腺细胞，其抗原是肾小球系膜细胞膜上的Thy11分子[20]。经静脉给“Wistar大鼠”注射mAb 1-22-3（500 μg）30 min后，在系膜区域可检测到mAb 1-22-3颗粒状沉着，模型鼠出现蛋白尿；30 min～2 h后，系膜区域出现IgG和C3沉积、炎症细胞浸润；1～2 d后，肾小球内出现毛细血管扩张和系膜溶解；3～5 d后，肾小球内出现系膜细胞增殖、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、I型胶原（collagen type I）表达增强，模型鼠蛋白尿达到峰值（500 mg・d-1）；此后，蛋白尿水平逐渐下降，至14 d时，尿蛋白基本恢复正常；2～3月后，上述补体依赖的系膜病变能够自发性缓解。因此，日本Niigata大学清水不二雄、河内裕等学者将单次注射mAb 1-22-3所诱导的抗Thy11抗体肾炎（anti-Thy11 antibody nephritis）模型称为“可逆性抗Thy11抗体肾炎” [21-22]。因为抗Thy11抗体肾炎模型具备系膜细胞增殖、细胞外基质沉积等类似人类MsPGN的显著特征，所以，被广泛用于研究伴有系膜损伤的急、慢性肾小球肾炎的进展机制，其中，有关转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β/Smads、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和整合素等信号转导通路的研究在近年来取得了重要进展。此外，由于该模型有很好的安全性和稳定性，还用于抗肾炎药物的开发，如全反式维甲酸[23]、辛伐他汀[24]以及单味中药制剂――雷公藤多苷片[25-28]的抗肾炎效果等。

4 急性肾小球肾炎模型――BSA肾炎

给予实验动物抗毒素血清（异种动物的血清）就会引起急性血清病（serum disease），表现出类似人类急性肾小球肾炎（简称“急性肾炎”）的症状。其中，用大剂量（250 mg・kg-1）牛的血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）一次性静脉注射可以诱导出“BSA肾炎（bovine serum albumin nephritis）”[29]。该模型用于研究人类急性溶血链球菌感染后肾小球肾炎（急性肾小球肾炎）的发病机制。研究表明，BSA肾炎是由外来的抗原/抗体免疫复合物在肾小球沉积而引发的肾损害，免疫复合物沉积的部位依赖于机体产生抗体的种类和免疫复合物的大小，其病理特征可能是弥漫性增殖性肾小球病变，也可能是局灶性肾小球病变。诱发BSA肾炎的2种抗原分别是SPEB[30]和NAPlr[31]。

近年来，日本学者永松等用小剂量兔血清白蛋白（rabbit serum albumin，RSA）致敏大鼠，接着，每日连续给实验鼠注射小剂量RSA而诱导出BSA肾炎。有趣的是，连续注射抗原后，实验鼠并没有出现急性肾炎的病理特征，而是表现出类似人类慢性肾炎终末期的病理特征，也就是弥漫性肾纤维化；若中途停止注射抗原，那么，在肾小球内沉积的免疫复合物也会随之消失，而且，实验鼠（小鼠）的肾小球病变可以被前列腺素E1（prostaglandin E 1，PGE1）所抑制[32]。这一结果提示，小剂量RSA诱导的BSA肾炎也可以模拟人类慢性肾炎的病理过程。

5 IgA肾病模型――HIGA小鼠

人类IgA肾病（IgA nephropathy）的病理特征包括肾小球系膜组织IgA免疫球蛋白沉积和系膜细胞增生。1991年，Montinaro等把异种动物血清白蛋白DNP-BSA作为抗原免疫BALB/C小鼠，使其产生MOPC-315骨髓瘤，再将其血清IgA制作成免疫复合物，作为抗原给实验鼠静脉注射，这样，就复制出肾小球内含有IgA和C3的动物模型[33]。人类的IgA肾病往往在上呼吸道感染后会进一步加重，因此，推测其可能与呼吸道病毒诱发的免疫反应有关。一旦用各种蛋白质抗原经口免疫小鼠，肾小球系膜内就会有IgA和C3沉积，并产生长期的免疫反应，这种小鼠模型的特点也类似人类IgA肾病。另外，1997年，日本学者武曾等用高IgA血症的ddY品系小鼠研制出“HIGA小鼠”，该小鼠有明确的高IgA血症和系膜内IgA沉积，与人类IgA肾病极为相似。可是，令人遗憾的是，HIGA小鼠模型的血尿和蛋白尿过于轻微，这与人类IgA肾病很不一致[34]。Tujimoto等通过对HIGA小鼠肾脏的全基因组分析而发现PDGF-EDG5表达亢进的小鼠品系[35]。近年来，日本学者永松等把HIGA小鼠肾小球进行高纯度分离，采用断面分析其基因表达。结果表明，在促进细胞外基质分解的金属蛋白酶中，甲基多巴基因表达水平下调是该模式动物肾小球系膜增殖的原因之一[36]。

6 狼疮性肾炎模型――NZB/WF1小鼠

以面部红斑、发热、关节痛和晨僵等为临床特征的系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）属于风湿免疫性疾病。SLE患者血中的ds-DNA抗体与抗原结合而形成免疫复合物，沉积在体内各组织、器官中。若累及肾脏，即为狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）。临床表现为蛋白尿、肾病综合征以及进行性肾功能减退。其肾组织病理特征涵括原发性肾小球肾炎各种病理类型，借助免疫荧光染色可发现其系膜或毛细血管网内有免疫球蛋白和补体成分呈颗粒状沉淀[37]。

目前，用于狼疮性肾炎研究的模型是NZB/WF1小鼠。1959年，新西兰奥塔哥大学的学者首先研制出伴有自身免疫病的黑毛NZB小鼠，把没有自身免疫病的白毛NZW小鼠与其便可获得NZB/WF1小鼠。雌性的NZB/WF1小鼠会出现严重的狼疮性肾炎相应症状，其血液中的抗体、肾组织病理特征以及荧光抗体特征与人类狼疮性肾炎非常相似，而且，肾炎的进展与体内补体水平低下、补体活化程度密切相关[38]。此后，Hirose等发现NZB小鼠第4号染色体C1q基因近旁有狼疮性肾炎易感性基因。研究表明，NZB或NZW小鼠自身抗体产生的原因与来源于脾脏细胞的白介素（Interleukin，IL）-4产生增加、Th-2细胞免疫反应亢进有关[39]。另外，MRL/lpr小鼠也是有名的狼疮性肾炎模型。MRL/lpr小鼠出现狼疮性肾炎的原因，一是因为诱导凋亡的Fas抗原基因突变而引起淋巴细胞增殖；二是因为针对自身组织的抗体增加而形成免疫复合物。这类模式动物的肾脏病理特征是比较复杂的，有的类似系膜增殖性肾炎，有的类似膜性肾病[40]。在治疗方面，FK506和IL-6单克隆抗体被证明是有效的[41]。

7 足细胞病模型――抗nephrin抗体肾炎、嘌呤霉素肾病

1998年，Tryggvason等在芬兰型先天性肾病综合征患者中发现肾小球上皮细胞（足细胞）nephrin基因异常，nephrin作为足细胞裂孔膜（slit diaphragm，SD）关键性结构蛋白，其表达水平与蛋白尿的发生密切相关[42]。此后，国际肾脏病学界便出现了足细胞生物学（podocytology）这一概念。近年来，对于包括nephrin在内的足细胞裂孔膜结构蛋白的认识成为研究人类足细胞病（podocyte disease）和蛋白尿发病机制的突破口[43]。

1988年，日本Niigata大学清水不二雄、河内裕等学者研制出针对大鼠足细胞裂孔膜nephrin的单克隆抗体――“mAb 5-1-6（等电点57的抗IgG1抗体）”，该抗体不但能诱导实验鼠出现大量蛋白尿，而且，可以直接与nephrin特异性结合，使其表达下调而引发足细胞病，即抗nephrin抗体肾炎[44]。研究表明，除Sprague-Dawley（SD）大鼠以外，Wistar大鼠、Brown-Norway大鼠以及Lewis大鼠在静脉注射mAb 5-1-6后3～5 d便出现显著的蛋白尿（> 100 mg・d-1）。该模型鼠肾小球在光镜下的病变是很轻微的，既没有炎症细胞浸润，也没有补体C3表达；而电镜显示足细胞有广泛的足突融合，GBM机械屏障被明显破坏。给上述实验鼠每周2次注射mAb 5-1-6，持续6个月，可诱导出伴有大量蛋白尿（> 400 mg・d-1）的足细胞病模型[45]。

另外，可以直接损害足细胞的还有一些药物，如嘌呤霉素（puromycin aminonucleoside，PAN）、阿霉素（adriamycin，ADR）以及柔红霉素（daunomycin）等。给大鼠连续静脉或腹腔注射PAN，其肾脏的病变特征与人类微小病变综合征（minimal change nephritic syndrome）极为相似，虽然光镜下看不到肾小球的改变，但是，借助电镜可以发现足细胞足突广泛融合，实验鼠出现了明显的蛋白尿[46]。ADR是临床上常用的抗肿瘤药物，给大鼠静脉注射ADR，大约5 d左右实验鼠出现蛋白尿；在给药的第2周，肾小球足细胞出现明显的空泡状改变，并伴有系膜增殖；在给药的第4，5周蛋白尿达到高峰[47]。研究表明，PAN或ADR诱导的足细胞病都与足细胞氧化应激损伤机制有关[48]。

通过转基因技术也可以制作足细胞病模型。Matsusaka报道，把抗人CD25抗体和假单胞菌外毒素变异体结合而生产出重组免疫毒素，将该毒素给小鼠注射，就可制作出足细胞特异性表达CD25的转基因小鼠。这种转基因模型鼠的足细胞病变与免疫毒素使用量密切相关。只有小剂量的免疫毒素才能维持模型鼠生存4周，其肾组织病变可出现类似人类局灶节段性肾小球硬化（足细胞病）的特征[49]。

8 糖尿病肾病模型――链脲佐菌素肾病、db/db小鼠

国内外所采用的糖尿病动物模型包括“自然发病、药物诱导、基因转染”等3类，其中，链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的大鼠糖尿病模型应用最为广泛。STZ是通过破坏胰腺β细胞DNA而诱发类似人类的1型糖尿病，该模型发病迅速，必须依靠胰岛素维持血糖，并且，具有“白蛋白尿、肾小球肥大、GBM增厚、系膜细胞增生、ECM沉积”等类似人类糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）的基本特征。研究表明，STZ必须溶解在生理盐水和005 mol・L-1柠檬酸混合液中（pH 45），在5 min内按45～90 mg・kg-1剂量经尾静脉或腹腔注射STZ，才能诱导出轻重程度不同的糖尿病大鼠模型。对于小鼠而言，STZ的静脉给药剂量必须是150～300 mg・kg-1。大鼠在注射STZ后2周，白蛋白尿排泄量逐渐增高；在注射STZ后1～3个月，肾小球内出现代表性致纤维化细胞因子――TGF-β表达增加；在注射STZ后3～6个月，肾小球内出现GBM增厚和系膜增殖。尽管如此，类似人类DN的特征性结节样病变却未能出现[50]。

此外，db/db小鼠是常用的2型糖尿病模型。db/db小鼠是由C57BL Ksj系小鼠第4染色体基因突变而来的，称之为C57BL Ksj-db/db小鼠[51]。研究表明，瘦素受体缺失是该小鼠出现糖尿病的原因，表现为肥胖、高胰岛素血症、高瘦素血症以及高血糖等。与非糖尿病的正常db/m小鼠相比，db/db小鼠出生后6～8周出现高血糖，10～12周出现尿白蛋白排泄量增多，16周后出现血清肌酐清除率上升，15～24周出现类似人类DN的系膜增殖、肾小球硬化以及致纤维化细胞因子TGF-β，TGF-β II表达增多，ECM成分――纤维连接蛋白、4型胶原蛋白增多等[52]。

综上所述，各种施加人为操作的肾脏病动物模型都有一个共同的特点，那就是，实验动物最初的肾脏受损解剖部位决定着其组织形态和生理功能的变化。就肾小球而言，以GBM为界，可分为管内（endocapillary）区域和管外区域（extracapillary）。基于这样的肾脏解剖部位，日本学者提出，实验性肾脏病动物模型可以做如下归类，也就是“血管内损伤模型”，包括ConA肾炎[53]模型等；“内皮下-系膜损伤模型”，包括BSA肾炎模型、狼疮性肾炎模型、抗Thy11抗体肾炎模型等；“GBM-上皮下损伤模型”，包括马杉肾炎模型、Heymann肾炎模型等；“上皮损伤模型”， 包括抗nephrin抗体肾炎模型、嘌呤霉素肾病模型等[3]。笔者认为，目前，对于肾脏病领域的药效学、药理学研究而言，尤其是中药治疗慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）作用和机制的相关基础研究，首要的是“正确认识各种肾脏病动物模型的特点，针对实验的具体目的而选择合适的模型（图1）”；其次，中医药干预CKD的药理研究需要“病证结合动物模型”的支撑。陈可冀院士指出：病证结合是我国中医临床的基本模式，也是中西医结合医学的重要理论创新[53]。然而，迄今为止，在肾脏病基础研究领域，还没有一个实验性肾脏病动物模型能符合病证结合模型的基本要求。单纯的肾脏病动物模型，因其中医证候特征不明显而不能满足辨证论治理论指导下的中药药效学研究，所以，建立具有中医证候特征的肾脏病动物模型是今后的发展方向。

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Recognition of experimental animal model with kidney disease

WAN Yi-gang1，2，3， HUANG Yan-ru2， SUN Wei2*， MAO Zhi-min2， SHI Xi-miao2， YAO Jian2，4

（1Department of Traditional Chinese Medicine， Nanjing Drum Tower Hospital， The Affiliated Hospital of

Nanjing University Medical School， Nanjing 210008， China；

2 Research Institute of Kidney Disease， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210029， China；

3 Department of Cell Biology， Institute of Nephrology， Niigata University Graduate School of Medical and Dental Sciences，

Niigata 951-8510， Japan；

4 Department of Molecular Signaling， University of Yamanashi， Yamanashi 409-3898， Japan）

[Abstract] Animal models with kidney disease are generally divided into two types One belongs to the models which imitate human kidney disease by the artificial operations，such as anti-glomerular basement membrane antibody nephritis，Heymann nephritis，anti-Thy11 antibody nephritis，BSA nephritis and puromycin nephropathy The other one pertains to the models which make themselves kidney disease，and appear the pathological characteristics naturally as like as human，such as HIGA mice with IgA nephropathy and NZB/WF1 and MRL/1pr mice with lupus nephritis In addition，the transgenic animal models with kidney disease can also be established by the modern molecular biologic techniques including gene knockout and siRNA transfection As for the studies related with kidney disease in pharmacodynamics and pharmacology of Chinese herbal medicine（CHM），it is important to understand deeply the features of each animal model with kidney disease，and select accurately the proper models according to the different experimental objectives，and then，build the special models provided with the combination of disease with syndrome in traditional Chinese medicine（TCM）. Therefore，it is the developmental direction for the further study to establish animal models with kidney disease，which should possess the characteristics of syndrome in TCM

[Key words] kidney disease； animal model

doi：10.4268/cjcmm20142101