九味白术汤对实验性溃疡性结肠炎大鼠血清白介素—1β及白介素—10的影响

[摘要] 目的 观察九味白术汤（JWBZ）对溃疡性结肠炎（UC）大鼠血清白介素-1β（IL-1β）及白介素-10（IL-10）水平的影响。 方法 48只大鼠完全随机分为正常对照组、模型组、柳氮磺胺吡啶（SASP）组、JWBZ高剂量组、中剂量组与低剂量组；采用2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）复制大鼠溃疡性结肠炎模型；连续给药10天后，观察UC大鼠结肠黏膜损伤指数（CMDI）、血清IL-1β及IL-10水平的变化。多组间比较采用单因素方差分析。 结果 正常对照组、模型组、JWBZ低、中、高剂量组及SASP组的CMDI分别为：（0.25±0.46）、（3.38±1.06）、（1.63±0.92）、（1.50±0.53）、（2.50±0.93）、（2.38±0.74）分；相应的IL-1β水平分别为：（232.94±21.77）、（756.67±71.70）、（469.57±71.13）、（401.97±39.24）、（598.93±45.34）、（655.66±10.51）ng/L；IL-10水平分别为：（52.14±7.07）、（20.19±5.17）、（56.79±9.47）、（63.96±9.37）、（41.73±10.55）、（51.13±2.81）ng/L。与正常对照组比较，模型组CMDI显著增加（P < 0.01），血清IL-1β水平显著升高（P < 0.01），而血清IL-10水平显著降低（P < 0.01）；与模型组比较，JWBZ低、中、高剂量组及SASP组CMDI均显著降低（P < 0.05或P < 0.01），血清IL-1β水平均显著降低（P < 0.05或P < 0.01），而血清IL-10水平显著升高（P < 0.01）；与SASP组比较，JWBZ中剂量组CMDI显著降低（P < 0.05），高、中剂量组血清IL-1β水平显著降低（P < 0.01）；中剂量组血清IL-10水平显著升高（P < 0.01），而低剂量组血清IL-10水平显著降低（P < 0.05）。 结论 JWBZ对UC大鼠结肠损伤具有良好的修复作用，其机制可能通过调节促炎因子与抗炎因子的平衡实现。

[关键词] 九味白术汤；溃疡性结肠炎；大鼠；结肠黏膜损伤指数；白介素-1β；白介素-10

[中图分类号] R574.62 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）07（a）-0040-03

溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性非特异性炎症性肠病，主要累及直肠和乙状结肠，常迁延不愈，严重影响了患者的工作与生活，且该病与结肠癌密切相关，被世界卫生组织列为现代难治之病[1]。UC的病因及发病机制复杂，其中免疫反应异常是UC的重要病因[2]。七味白术散来源于宋代钱乙的《小儿药证直诀》，具有益气补中、和胃生津的功效，现代多用于小儿腹泻[3]。笔者以七味白术散为基础加入红藤、白及，形成“九味白术汤（JWBZ）”，用于UC的治疗初显疗效。本研究观察JWBZ对实验性UC大鼠的治疗作用，并探讨该方对UC大鼠血清免疫因子白介素-1β（IL-1β）与白介素-10（IL-10）的影响，为JWBZ治疗UC提供客观依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 PF级Wistar大鼠48只，体重180～220 g，雌雄各半。由南方医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2011-0015。

1.1.2 药品与试剂 JWBZ组成：党参20 g，白术15 g，茯苓15 g，藿香15 g，甘草5 g，葛根30 g，木香10 g，红藤30 g，白及15 g；柳氮磺胺吡啶（SASP）（上海三维制药有限公司，国药准字H31020450）；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）（美国Sigma公司）；大鼠IL-1β与IL-10 ELISA试剂盒（上海基米生物科技有限公司）。

1.1.3 仪器 ELX800通用酶标仪（美国BioTek公司），Avanti J-26XP离心机（美国Beckman公司），UWB-10P恒温水浴箱（常州诺基仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模 大鼠适应性喂养1周后，按完全随机化原则分为6组：正常对照组、模型组、SASP组、JWBZ高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组8只。采用TNBS造模法制备大鼠UC模型。各组大鼠禁食不禁水24 h，乙醚麻醉，以直径2 mm的乳胶管经轻轻插入深约8 cm，用注射器往模型组、SASP组及JWBZ高、中、低剂量组大鼠的肠腔内注入25 g/L的TNBS 50%乙醇溶液，2 mL/kg；注完后将大鼠的尾部提起，倒置30 s后平放，待其自然清醒，术后常规饲养；正常对照组肠腔内注入等量生理盐水。

1.2.2 给药剂量 ①JWBZ常用剂量转换成大鼠的等效剂量为16.28 g/kg，以此剂量为中剂量；低剂量为中剂量1/2，即8.14 g/kg；高剂量为中剂量的2倍，即32.55 g/kg；②SASP：按标准体重成人每日剂量50 mg/kg，大鼠等效剂量为315 mg/kg。

1.2.3 药液制备 ①供试液：将JWBZ适当粉碎，加入10倍量蒸馏水浸泡半小时后，常规煎煮1 h，过滤，滤渣再加入8倍量蒸馏水，同第1次煎煮，过滤，弃药渣，合并两次水煎液，常规浓缩1.6 g/mL，置于4℃冰箱保存备用；给药时用37℃水浴，原浓度作为高剂量给药浓度，部分稀释至0.8 g/mL作为中剂量给药浓度，部分稀释至0.4 g/mL作为低剂量给药浓度。②SASP对照液：取片剂，用刀刮除外部肠溶衣，研成细粉，临用时以蒸馏水制成15.8 mg/mL的混悬液。

1.2.4 给药方法 造模2 d后，SASP组按20 mL/kg灌胃给予SASP混悬液，连续给药10 d；JWBZ高、中、低剂量组分别按相应剂量灌胃给予相应浓度的药液，20 mL/kg，连续给药10 d；正常对照组和模型组灌胃给予等量生理盐水，连续给药10 d。

1.2.5 指标观测 末次给药后，大鼠禁食不禁水12 h，按1.0 g/kg的剂量腹腔注射20%乌拉坦麻醉，开腹腹腔静脉取血约5 mL，置无菌试管中静置2 h，37℃水浴孵育20 min，以4000 r/min离心10 min，分离血清，于-20℃冰箱保存，用ELISA法测定IL-1β、IL-10水平。大鼠取血后分离结肠，沿肠系膜缘剪开肠腔，生理盐水冲净后，平铺于玻璃板上，对结肠黏膜损伤指数（CMDI）进行评分。评分标准为[4]：0分：无损伤；1分：黏膜充血、水肿，未出现溃疡；2分：黏膜充血、水肿，轻度糜烂，无溃疡；3分：黏膜充血、水肿，中度糜烂，有单个溃疡；4分：黏膜充血、水肿，高度糜烂，有多处溃疡；5分：黏膜充血、水肿，重度糜烂，有直径>1 cm溃疡。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠CMDI评分比较

6组间CMDI评分有显著性差异（F=14.148，P=0.000）；与正常对照组比较，模型组大鼠CMDI评分显著增加（P < 0.01）；与模型组比较，JWBZ低、中、高剂量组及SASP组CMDI评分均显著降低（P < 0.05或P < 0.01）；与SASP组比较，JWBZ中剂量组显著降低（P < 0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠血清IL-1β及IL-10水平比较

6组间IL-1β及IL-10水平均有显著性差异（F分别为119.846、30.097，P分别为0.000，0.000）；与正常对照组比较，模型组大鼠血清IL-1β水平显著升高（P < 0.01），而血清IL-10水平显著降低（P < 0.01）；与模型组比较，JWBZ低、中、高剂量组及SASP组血清IL-1β水平均显著降低（P < 0.05或P < 0.01）；而血清IL-10水平显著升高（P < 0.01）。与SASP组比较，JWBZ高、中剂量组血清IL-1β水平显著降低（P < 0.01）；中剂量组血清IL-10水平显著升高（P < 0.01），而低剂量组该指标显著降低（P < 0.05）。见表2。

3 讨论

UC属中医学“痢疾”、“泄泻”、“便血”、“肠风”及“脏毒”等范畴。本病主要病变在于脾胃与大小肠，与肝肾关系密切，而脾虚、湿盛是本病的重要致病因素。JWBZ由七味白术散加红藤与白及而成，方中党参益气补脾，白术健脾燥湿，茯苓渗湿健脾，甘草甘缓和中；藿香芳香化湿、和胃健脾，木香行胃肠气滞，能健脾胃，葛根退热生津止渴，又升发清阳，鼓舞脾胃之气上行，而止泄泻；红藤清热解毒，活血通络，败毒散瘀；白及止血消肿，生肌敛疮。诸药合用，共奏健脾化湿，行气止痢，化瘀生新之效，对溃疡性结肠炎起到良好的治疗作用。本研究采用经典的TNBS/乙醇灌肠法制备大鼠UC模型，其病理变化与人类UC十分相似[5]。实验结果显示，不同剂量的JWBZ可显著降低UC大鼠模型的CMDI评分（P < 0.01），且JWBZ中剂量组CMDI显著低于SASP组（P < 0.05），表明该方对UC的结肠损伤具有良好的修复作用。

免疫异常被认为是UC的重要病因[2]，包括炎症递质、细胞因子及免疫调节等因素，其中细胞因子参与免疫反应和炎症过程。IL-1是一种具有炎症介导活性和免疫调节作用的细胞因子，以IL-1α和IL-1β两种形式存在，其中IL-1β与UC的发病密切相关[6]。UC结肠黏膜活化的单核巨噬细胞释放大量IL-1β，直接介导UC免疫反应；IL-1β还可增加白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-18（IL-18）等炎症因子的分泌，引起一系列肠道炎性反应和局部组织的破坏，导致UC发生。研究发现，UC结肠黏膜组织中IL-1β水平与UC的炎症程度密切相关，可以作为UC严重程度和疗效的判断指标[2]。IL-10为细胞因子合成抑制因子，对激活的单核细胞、巨噬细胞、粒细胞及T细胞等有抑制作用，可下调白介素-2（IL-2）、白介素-3（IL-3）、γ干扰素（IFN-γ）等促炎因子水平，具有广泛的免疫抑制活性。实验发现，IL-10基因缺陷小鼠能自发慢性结肠炎症[7]；发生UC时，IL-10分泌减少，而补充IL-10能够减缓UC的发生与发展[8-10]，表明IL-10对调节肠道黏膜免疫系统的平衡，保护肠黏膜具有重要作用。

本研究结果显示，UC模型大鼠血清IL-1β显著升高，IL-10水平显著降低（P < 0.01），是UC大鼠免疫异常的表现；而JWBZ可显著降低UC大鼠血清IL-1β水平，同时显著升高IL-10水平（P < 0.01），且效果优于SASP，尤以中剂量JWBZ为佳。表明JWBZ可调节UC大鼠促炎因子IL-1β与抗炎因子IL-10的平衡，从而抑制大鼠UC的炎性反应。因此，免疫调节可能是九味白术汤有效促进UC结肠黏膜修复的作用机制之一，但其更深入的作用机制有待于进一步的研究。

[参考文献]

[1] 中华医学会消化病学分会炎症性肠病协作组.对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见[J].胃肠病学，2007，12（8）：488-495.

[2] 曹秀红，张学彦，张晓娜.白介素在溃疡性结肠炎发病机制中的研究进展[J].世界华人消化杂志，2011，19（30）：3143-3148.

[3] 陈丹，陈文利.七味白术散治疗小儿腹泻研究概况[J].辽宁中医药大学学报，2012，14（3）：230-232.

[4] Mi1lar AD，Rampton DS，Chander CL，et al. Evaluating the antioxidatant Potential of new treatments for inflammatory bowel disease using a rat model of colits [J]. Gat，1996，39（1）：93-95.

[5] 吴小庚，王爱磊，张学明，等. 实验性溃疡性结肠炎大鼠模型的建立[J].河北医药，2011，33（4）：493-495.

[6] Yamamoto T，Maruyama Y，Umegae S，et al. Mucosal inflammation in the terminal ileum of ulcerative colitis patients： endoscopic findings and cytokine profiles [J].Dig Liver Dis，2008，40（4）：253-259.

[7] Haub S，Ritze Y，Bergheim I，et al. Enhancement of intestinal infammation in mice lacking interleukin 10 by deletion of the serotonin reuptake transporter[J]. Neurogastroenterol Motil，2010，22（7）：826-834.

[8] Li MC， He SH. IL-10 and its related cytokines for treatment of inflammatory bowel disease [J]. World J Gastroenterol，2004，10（5）：620-625.

[9] 魏炜，黄萍，张绍丹，等.白细胞介素-4和白细胞介素-12对纯化培养小鼠视网膜神经节细胞存活的影响[J].中国实验动物学报，2011，19（4）：282-286.

[10] 吴剑平，杨斐，胡樱.常规实验操作对Wistar大鼠的影响[J].中国实验动物学报，2010，18（4）：312-317.

（收稿日期：2013-03-13 本文编辑：卫 轲）