HO-1及COX-2在心肌缺血预适应的保护作用

【中图分类号】 R318 【文献标识码】 A 【文章编号】1185-1672(2009)- 04-0304-03

摘要 缺血预适应( ischemic preconditioning, IPC)是体内普遍存在的一种强大的自身的保护机制。近二十年来，对心肌缺血预适应的保护机制进行了大量的研究，虽然取得了巨 大的进步，但是对其保护作用的确切机制以及与热休克蛋白的关系还存在争议。近几年来， 对小分子蛋白的保护作用特别受到关注，本文对心肌缺血预适应的保护作用机制与血红素氧 合酶-1(HO-1)及还氧化酶-2(COX-2)的关系研究进展作一简要综述。

关键词 缺血预适应;血红素氧合酶-1 还氧化酶-2;心肌保护

1 HO-1的生物性质及生物学作用

HO(Heme Oxygenase，血红素氧合酶)最早是由Tenhunen等［1］于1968年在动物 肝脏微 粒体中发现的,后来被命名为HO-1。HO-1多分布于脾脏和肝脏,是诱导型酶,其分子量为32kD,又被称为热休克蛋白32 (HSP32)［2］。人HO-1大约有233个氨基酸。HO-1基因定位 于人染 色体22q12，具有4个内含子和5个外显子,在其操纵子内有热激元件(HSE)、AP-1 结合区、NF -κB 结合区和金属反应元件。转录因子与这些特异位点结合将引起HO-1基因的活化。

HO是血红素分解代谢过程中的起始酶和限速酶，能在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide- dinucleotide-phosphate,NADPH)和细胞色素P-450还原酶及分子氧作用下,催化血红素降解 产生等摩尔的胆绿素,CO和游离铁,CO是一种重要的信使分子,CO通过激活cAMP和p38有丝分裂 原激活蛋白激酶(p38-MAPK),在体内可抑制球囊损伤后内膜增厚,体外抑制血管平滑肌细胞增 殖［3］；而胆绿素在胆绿素还原酶作用下生成胆红素，胆红素后具有很强的抗氧化 能力,体外实验发现胆红素可保护培养的内皮细胞和神经细胞的抗氧化性损伤［4－6］。 F oresti 等［7］在细胞培养液中加入胆红素可明显增强细胞抗氧化损伤能力.游离铁与蛋白结 合形成 铁蛋白, Balla等［8］的研究显示,铁蛋白亦有抗氧化损伤和细胞保护功能,而且这种 功能独 立于HO-1活性.Otterbein等［9］在由内毒素造成的休克模型中用外源性铁螯合剂除 去铁离子,由于没有铁蛋白的形成,这种保护作用消失。

人类和哺乳动物体内H0有3种同工酶即HO-1、HO-2和H0-3。H0-1为诱导型，相对分子质量为3 2 000 000，广泛分布于全身组织，在心、肺、肾、肝脏、脾脏、骨髓和网状内皮细胞中表 达较多，尤以脾脏中活性最高。HO-1可以被多种物质或刺激因素诱导表达如热休克、重金属 、内毒素、血红素、氧化应激、辐射等。在应激状态下H0-1适量表达可以减轻细胞损伤、蛋 白质氧化及脂质过氧化，是细胞的一种内源性保护蛋白质。HO-1近年被公认为是一种重 要的 抗氧化剂及组织保护酶［10］。HO-2和HO-3是原生型的酶，HO-2为结构型，相对分子 质量为 36 000 000，主要分布于中枢神经系统、血管内皮、前列腺和中，是生理状态下HO的主 要形式。H0- 3特性与HO-2相似，与HO-1不同，也是结构型，存在于脑、肝脏、脾脏、 和肾脏等器官中，相对分子质量为33 000 000。

2 HO-1与心肌缺血预适应中的保护作用

氧化应激是缺血-再灌注损伤的一个重要发病机制，心肌再灌注损伤时H0表达增高，主要是 诱导型的H0-1［11］。HO系统是体内一个重要的抗氧化系统，主要通过其代谢产物发 挥抗氧 化作用，其中胆红素是体内清除过氧化脂质和超氧自由基的重要生理抗氧化物质，其抗氧化 作用强于维生素C和维生素E，不但可以清除超氧自由基，减轻膜脂质和蛋白过氧化，保护低 密度脂蛋白不被氧化。在心肌内具有抗氧自由基损伤的作用，而且又是H0- 1的诱导剂，能 诱导H0-1在体内高表达，加速血红素的分解代谢，从而减轻血红素的细胞毒性作用。游离铁 可与铁蛋白结合，中和铁的氧化毒性，表明铁蛋白也有抗氧化作用。随着对心肌缺血-再灌注损伤研究的不断深入，越来越多的证据显示以中性粒细胞浸润为主 的炎症是造成心肌再灌注损伤的重要机制之一。不断有心肌缺血-再灌注损伤中IL、肿瘤坏 死因子等炎症因子升高的报道，使得炎症与心肌缺血-再灌注的关系日益受到关注［12 -13］。H0-1可以抑制细胞间黏附分子-1 (ICAM-1)表达和单核细胞趋化，从而起到抑制 炎症反应的作用。研究发现HO代谢产物CO具有抗炎作用，可通过激活cA MP和p-38MAPK途径抑制细胞浸润和激活。

心肌缺血-再灌注损伤中有细胞凋亡现象，Tang等研究证实心肌缺血-再灌注损伤H0-1 高表达同时伴有Bcl-2水平升高及Bax、Bak、caspase水平降低，Bcl-2是一种抗凋亡蛋白， 而Bax、Bak、caspase为促凋亡基因。Bcl-2能保护缺血-再灌注引起的凋亡，而促凋亡基因c aspase-3使心脏对缺血-再灌注损伤更敏感。目前细胞凋亡在心肌缺血-再灌注损 伤中的机制尚未完全阐明，可能与氧自由基和钙超载有关。HO-1可以通过其代谢产物CO而发 挥抗凋亡作用，CO有抗内皮细胞凋亡的作用。HO-1在心功能调节中起重要作用，Clark等研究发现心肌缺血30分钟后再灌注，可出 现心肌收缩力下降、血流动力学障碍、同时有线粒体破坏、组织损伤。如果在缺血前24小时 用氯化高铁血红素治疗能诱导HO-1表达，在离体小鼠心脏再灌注后可以改善心功能、降低心 肌梗死面积大小。HO-1表达和HO-1活性增高伴有心肌组织胆红素含量、胆红素释放到灌注缓 冲液中的浓度升高。而且在缺血前给低浓度 (100 nm)的外源性胆红素可恢复心功能、降低 心肌梗死面积大小和线粒体损伤。

业已证明，除严重缺血引起心肌细胞即刻坏死外，血液再灌注致心肌内大量中性粒细胞浸润 ，这些活化的中性粒细胞能不断产生活性氧(Reactive oxygen species, ROS),包括H2O2、O2-和ONOO等，它们对心肌细胞造成的氧化应激损伤不仅加速心肌细胞坏死，还会 诱导大量心肌细胞迟发性凋亡。

HO-1是体内重要的防御系统之一，在细胞和组织对应激适应反应中起着重要作用，近年，HO -1在心血管疾病中的保护作用研究倍受重视。CLERK 等曾报道， 诱导HO-1表达 具有显著的心脏保护作用，能改善心肌缺血后的心室功能。但目前的HO-1的研究多集中在动 物模型研究，在人体研究甚少。而且HO-1细胞保护功能是如何介导的，其代谢产物的具体生 物、细胞机制等方面有待进一步研究。能否在冠状动脉支架上涂上HO-1释放剂和利用转基因 技术以防治冠状动脉支架术后再狭窄，有待于进一步探讨，相信随着研究的深入，HO-1可为 临床防治冠心病提供一条新的途径。

2．1 COX-2的生物学性质及作用环氧化酶( cyclooxygenase,COX )又称前列腺素( PG ) 合成酶 (PGHS)，是前列腺素合成过程中一个主要的限速酶。人体细胞内的花生四烯酸经过 环氧化酶的作用后产生数十种前列腺素(PG)。前列腺素E2(PGE2)是其中最为重要的通过受体 (EP1-EP4)而行使功能的活跃终端分子，基本上存在于人体的每一个部位。1976年首次从小 牛囊腺微粒体中分离得到COX-1，这是一种相对分子质量约7.1×104 的膜结合糖蛋白,其基 因结构被确定为2.7kb的碱基对。20世纪80年代末, Vane等发现了2.7kb以外的另一条 4kb的mRNA,并发现新的活性蛋白。从此研究者将COX分为COX-1和COX-2两种亚型,二者都是膜 结合蛋白,受两种独立基因编码,在被合成和转运后主要存在于内质网中。它们在功能上的差 异要大于在结构上的差异。然而，在1991年又一同工异构酶被发现，随后被命名为COX-2， 而且很快发现COX-1在大多数细胞中是构成型，承担基本的生理功能；而COX-2则是诱导型， 参与病理条件下的应急反应。人类COX-2基因于1995年被克隆,总长度8.3kb。传统认 为COX-1在绝大多数组织中呈组成型表达，主要合成PGI2、TXA2、PGD2 和HHT(12-hydroxy25 ,8,10-heptade-catrienoic acid) 4种PGs，也合成少量的PGE2，在保护胃肠道粘膜、调节 血管张力、维持血小板和肾脏正常生理功能中起“看家”作用。COX-2是由于炎症因子，如 脂多糖、肿瘤坏死因子、白细胞介素-1、血小板源生长因子，以及其他生长因素诱发不同的 信号经p38MAPK 传导系统的瀑布传递而产生,COX-1和COX-2基因具有不同的结 构，COX -1基因位于9q32-q33.3，而COX-2基因位于1q25。COX-2含有10个外显子和9个内含子，外显 子约8.3kb，其 mRNA 转录产物为4.5kb。上游 5'端非翻译区长约0.8kb，含有若干转录调控 序列。COX-2基因的转录、表达和调控也十分不同，调控主要在转录水平，与COX-2启动子转 录激活密切相关的多个转录因子结合部位有C/EBP、AP-2、SP1、NF-B、CRE、Ets-１、PEA-3和GATA-1。

2．2 COX-2与心肌缺血预适应中的保护作用 COX-2mRNA在正常心脏上几乎检测不到 ，但发现COX-2基因敲除的小鼠心肌发生了明显的纤维化提示COX-2可能参 与维持正 常的心肌功能。免疫印迹分析显示缺氧时(1%O2 )人脐静脉内皮细胞COX-2蛋白增加4倍以 上,Northern blot和RT2PCR均显示COX-2mRNA水平相应增加。由于COX-2可受多 种刺激诱导, 推测COX-2表达或活性的改变可能是缺血预处理或药物预处理过程产生的一种 共同的中介因子。在小鼠、兔等实验中发现, COX-2中介了缺血预处理的 延迟性心肌保 护作用。缺氧在不依赖于其它刺激物的情况下可使培养的人内皮细胞COX-2基因表达增加。B olli等在兔的缺血/再灌注损伤模型发现,缺血后24h即有COX-2蛋白及其代谢产物增加 ,认为COX-2表达及活性上调,对于预适应晚期的心肌顿抑和心肌梗死具有保护作用,而COX-2 抑制剂可使这种保护作用完全丧失。大量研究证实, 在心肌缺血预处理诱发的保护作用中,iNOS的表达增加是关键环节。除缺血预处理(IP)外,药物性预处理如腺苷、阿片物质 、内毒素衍生物等诱发的抗缺血损伤中,iNOS表达增加后导致NO合成增加是必要因素。Li等 人的研究发现，小鼠心肌经过iNOS转基因处理后可对抗缺血复灌性损伤, 缩小心肌梗死面积 ，且心肌COX-2蛋白和前列腺素类物质含量增加；用COX-2的特异性抑制剂可完全取消iNOS增 加引起的心肌保护作用。近来大量的研究发现, 除iNOS外,环氧化酶-2 (cyclo oxygenase-2, COX-2)可能是另一个中介了IPC保护作用的主要因素，据报道COX-2还 参与了其他药物预处理(如阿片受体激动剂) 对缺血心脏的晚期心肌保护作用。这提示COX-2 可能是多种预处理心肌保护过程中产生的一种共同的中介因子。而在IP过程中iNOS的增加确 实可以调节COX-2的活性。心脏移植过程中的短暂缺血亦能使供体心脏PGE2和P GF2a含量显著增加。采用电子自旋共振技术测得活性氧(reactjve oxygen spe cjes，ROS)在缺血后的复灌早期明显增加，而ROS引起的氧化应激被认为是在心肌缺血复灌 等心血管疾病 中导致心肌细胞损伤的主要因素。Addeiley等人的实验证实，过氧化氢(hydrogen peroxide ，H2O2)(体内一种主要的ROS)确实可引起大鼠心肌细胞COX-2表达上调。因此,我们可 以推断COX-2是心肌缺血预处理的保护性蛋白,当然不排除心肌受其他刺激也可增加COX-2的 表达。

3 心肌缺血预适应和HO-1及COX-2的临床研究

心肌缺血预处理是一种强大的心肌保护方法，但由于伦理方面的原因，对于其保护机制的临 床证据非常缺乏。梗死前的不稳定性心绞痛可以改善心肌梗死病人的预后，有人把这种不稳 定性心绞痛作为一种缺血预处理的一种效应。Guro Valen等报道，不稳定心绞痛病人的右心 房组织中明显高表达HSP72，HSP73，一氧化氮合酶（eNOS），HO-1，COX-2等，而这些都可 能是心肌的内源性保护物质。英国伦敦大学学院医院Hausenloy等报告,择期冠状动脉搭桥术 (CABG)时，远程缺血预适应有利于保护患者心肌。

4 HO-1及COX-2的共性

心肌短暂缺血时,可引发大量的血管活性物质从冠脉内皮细胞和/或心肌细胞释放, 其中缓激 肽被认为是参与IP心肌保护作用的主要活性物质。研究报道, 在长时间缺血后的复灌早期给 予外源性缓激肽, 可缩小心肌梗死面积。而HO-1及COX-2均有研究报道其共同通过的 途径为影响缓激肽的表达来对心肌缺血预处理的保护，并且二者均被认为是可诱发晚期心肌 保护［13］。

5 展望

心肌缺血预适应的心脏保护功能在临床和动物实验中均已得到证实，其机制虽不十分明确， 有些学者有不同意见，尤其对缺血区侧支循环的建立与否和缺血时间争议较大。据认为在每 次缺血的问歇期间机体可得到高能磷酸盐的补充及移除有害的谢物质。总之。缺血预适应为 心绞痛后的心脏保护开辟了一条新的途径，如何利用这一现象引入临床对心肌梗死患者进行 相应治疗，是今后进一步研究的课题。

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