重组人促红细胞生成素对急性脑缺血大鼠脑梗死体积及Nrf2、HO-1表达的影响

摘要：目的 研究重组人促红细胞生成素（rhEPO）对急性脑缺血大鼠脑组织中核因子E2相关性因子2（Nrf2）及血红素加氧酶（HO1）表达的影响，探讨rhEPO的抗氧化作用机制。方法 随机将36只雄性SD大鼠分为假手术组、缺血组和rhEPO治疗组。采用线栓法制作大鼠永久性局灶性脑缺血（pMCAO）模型。rhEPO治疗组在缺血2 h后腹腔注射rhEPO 5 000 IU/kg，模型组和假手术组在等时间点给予等量的生理盐水。TTC（2，3，5氯化三苯基四氮唑)法测量脑梗死体积，免疫组化方法测定脑组织中Nrf2及HO1的表达。结果 rhEPO治疗组与缺血组相比，脑梗死体积减小，各组脑组织中Nrf2及HO1的表达量按假手术组、缺血组、rhEPO治疗组依次增高，各组间差异均具有统计学意义（P

关键词:脑缺血；重组人促红细胞生成素；E2相关性因子2；血红素加氧酶；Keap1Nrf2/ARE抗氧化系统

中图分类号：R743 R255.2 文献标识码：A 文章编号：16721349（2012）08096902

氧化应激在急性缺血性脑损伤中发挥了重要的作用［1］。近年来有大量研究证实，重组人促红细胞生成素（rhEPO）在缺血性脑损伤中发挥了抗氧化作用［2］，但其作用机制仍不清楚。本研究采用大鼠永久性局灶性脑缺血（pMCAO）模型，通过对缺血脑组织中脑梗死体积、核因子E2相关性因子2（Nrf2）及血红素加氧酶（HO1）表达的研究，探讨rhEPO在缺血性脑损伤的抗氧化作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 36只健康雄性SD大鼠（山西医科大学实验动物中心提供），体重230 g～270 g。

1.2 药品及试剂 重组人促红素注射液（北京四环生物制药有限公司），Nrf2、HO1兔抗鼠多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，免疫组化用），PV6001二步法免疫组化检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），辣根过氧化物酶标记的二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 分组 随机将36只SD大鼠分为假手术组（n=12）、缺血组（n=12）和rhEPO治疗组（n=12）。每组随机选取6只行免疫组化。

1.4 模型制作与取材

1.4.1 模型制作 采用改良的ZeaLonga法［3］制备pMCAO 模型。大鼠在术前24 h禁食，术前4 h禁水，10%的水合氯醛(0.35 mL/kg)腹腔注射麻醉后，仰卧位，取颈正中切口，暴露并钝性分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)。结扎ECA远端、CCA近心端，用动脉夹夹住ICA，在CCA近分叉处约5 mm处剪一“V”型小口，将预先准备好的直径约0.26 mm的蘸有石蜡的尼龙线头轻轻插入CCA，从CCA分叉处计算，插入18 mm～20 mm时稍遇阻力即可停止，并结扎CCA，逐层缝合筋膜、皮肤，建立pMCAO模型。假手术组除插入鱼线约10 mm外，其余操作与缺血组相同。rhEPO治疗组在缺血2 h时腹腔注射rhEPO 5 000 IU/kg，假手术组与缺血组则给予等量的生理盐水。参考 Zea Longa评分标准，评分为0分和4分者均剔除。缺血24 h后处死大鼠。

1.4.2 取材 造模完成后，各组随机取6只在相应时间点心脏灌注去血后，断头取脑，经10%中性甲醛固定24 h后，取视交叉后1 mm～4 mm脑组织，石蜡包埋，切片行免疫组化。

1.5 脑梗死体积的测量 大鼠在缺血24 h后以10%水合氯醛麻醉后断头取脑，以生理盐水冲洗后，将脑组织迅速置于－20 ℃冰箱冻存20 min后取出，去除嗅球、小脑和低位脑干，切除额极和枕极，以2 mm间距行冠状位切片，共5片，然后浸于2%的TTC（2，3，5氯化三苯基四氮唑)磷酸盐缓冲液中，置于37 ℃

的水浴箱中染色30 min，再在4%的多聚甲醛溶液中固定12 h,取出后用数码相机照相，最后利用图像分析软件计算出梗死区域的面积，为了消除脑水肿的影响，梗死区域体积用占对侧大脑半球体积的百分比来表示。

1.6 免疫组化检测Nrf2及其HO1的表达 免疫组化方法严格按说明书染色步骤进行，抗原修复后，孵育一抗，Nrf2和HO1兔抗鼠多克隆抗体分别按1∶100和1∶200稀释。每片在高倍镜（400倍）下随机选取损伤侧（左侧）皮层范围内5个非重叠视野，利用ImagePro Plus软件计算平均阳性细胞数。

1.7 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件包进行分析，数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析和StudentNewmanKeuls (SNKq)检验。

2 结 果

2.1 各组大鼠脑梗死体积比较 TTC染色结果：脑组织梗死灶呈白色，正常组织呈红色，部分组织表现为由白色向红色过渡区。缺血组左侧半球梗死灶主要位于额顶叶皮质及纹状体。假手术组无梗死体积。与缺血组相比，rhEPO治疗组脑梗死体积明显减小，有统计学意义（P

2.2 免疫组化测定脑组织中Nrf2及HO1的分布与表达 假手术组可见HO1在细胞浆中有少量表达；缺血组阳性细胞增多，阳性细胞主要为缺血区的神经元和星形胶质细胞。与假手术组相比，差异有统计学意义（P

假手术组中有少量Nrf2浆阳性细胞，无明显核阳性细胞。缺血组可见明显的Nrf2核阳性细胞，核阳性细胞主要为缺血区的神经元和星形胶质细胞。与假手术组比较，差异有统计学意义（P