HPLC法测定珍杞降糖胶囊中绿原酸的含量

[摘要]　目的　建立珍杞降糖胶囊中绿原酸的HPLC含量测定方法。　方法　采用HPLC法，色谱柱为Agilengt　Eclipse　Plus　C18　柱（4.6　mm×100　mm）；流动相：乙腈-0.4%磷酸（17︰83）；流速：0.6　mL/min；检测波长：327　nm。　结果　绿原酸在0.043　3～0.693　8　μｇ范围内线性关系良好（r　=　0.999　9），平均加样回收率为98.39%，RSD　=　0.58%（n　=　6）。　结论　本方法简便快速、结果准确，可较好地控制该制剂的质量。

[关键词]　珍杞降糖胶囊；绿原酸；高效液相色谱法；含量测定

[中图分类号]　R927.2 [文献标识码]　A [文章编号]　1674-4721（2012）12（a）-0061-03

珍杞降糖胶囊为医院制剂，经过多年临床经验证明，其质量稳定，疗效可靠；由黄芪、玉竹、女贞子、金银花、珍珠母、赤芍、生地、郁金等9味中药材加工制成，具有益气养阴、生津止渴、凉血润燥之功效，主治阳虚燥热型消渴病。绿原酸为金银花的主要有效成分，绿原酸具有抗菌、消炎、止血的功效，对珍杞降糖胶囊疗效的发挥起重要作用。现行质量标准中只有定性检查项目，而没有定量检测指标，本文采用HPLC测定了金银花中绿原酸的含量，方法简便、快捷、准确，回收率高，可较好地控制该制剂的质量。现报道如下：

1　仪器与试药

1.1　仪器

Agilengt　1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），AUW-220D电子分析天平（日本岛津公司），DSQ10260超声仪（上海特惠电子仪器有限公司）。

1.2　试药

绿原酸对照品（来源：中国药品生物制品检定所；批号：110753-200212）；水为杭州娃哈哈饮用纯净水，乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯。珍杞降糖胶囊（生产单位：市中医院；批号：110328、110507、110713）。

2　方法与结果

2.1　色谱条件及系统适应性试验

色谱柱：Agilengt　Eclipse　Plus-C18色谱柱（4.6　mm×100　mm）；0.4%磷酸-乙腈（83︰17）为流动相；检测波长为327　nm；柱温：30℃；流速为0.6　mL/min；进样量为10　μL。理论板数按绿原酸峰计算应不低于1　000[1]。

2.2　对照品溶液的制备

精密称取绿原酸对照品约10　mg，置50　mL容量瓶中，加50%甲醇30　mL，超声5　min使溶解，并定量稀释制成每1毫升中含绿原酸0.2　mg的溶液，作为对照品储备液（10℃以下保存）。精密量取上述储备液5　mL置25　mL棕色容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.3　供试品溶液的制备

精密称取本品内容物约6.0　g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50　mL，、称定重量，超声处理（功率250　W，频率35　kHz）30　min，放冷，称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5　mL，置25　mL棕色容量瓶中加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.4　阴性样品溶液的制备

精密称取不含金银花的其他各味中药材约6.0　g，研碎，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50　mL，称定重量，超声处理（功率250　W，频率35　kHz）30　min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10　mL，置50　mL棕色容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得阴性对照溶液。

2.5　标准曲线的制备

取绿原酸对照品溶液（浓度为40　μg/mL），按“2.1”项下色谱条件分别精密进样1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00　μL，记录绿原酸色谱峰的面积值，以色谱峰峰面积为Y，以对照品进样量为X，计算回归方程：Y　=　5　442.127　16X-33.940　86，r　=　0.999　9。结果显示，在0.043　3～0.693　8　μｇ范围内绿原酸进样量与峰面积值呈良好的线性关系。

2.6　阴性干扰试验

按“2.1”项下色谱条件分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10　μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，结果绿原酸在4.054　nm波长处有最大吸收，理论板数在4　000以上，绿原酸峰与其他组分峰基线分离（R　＞　1.5），阴性样品溶液在绿原酸峰相应位置上对测定无干扰，见图1。

2.7　稳定性试验

按“2.1”项下色谱条件下，取绿原酸对照品溶液（浓度为40　μg/mL），每隔1小时进样1次，考察6次，每次10　μL，记录绿原酸峰面积，绿原酸峰面积分别为927.031　47、925.091　86、923.421　96、916.204　73、909.151　97、910.778　66，RSD　=　0.83%，实验证明，对照品溶液稳定性良好，能够满足测试要求。

2.8　加样回收率试验

精密称取已知含量的供试品（批号110328，含绿原酸0.535　3　mg/g）6份，每份约2.0　g，分别置1～6号锥形瓶中，分别精密加入精密配制的绿原酸对照品储备液（浓度为0.2　mg/mL）5　mL，精密加入50%甲醇50　mL，照供试品溶液制备方法制备样品溶液，按“2.1”项下色谱条件，进样量10　μL，分别测定，结果见表1。

2.9　精密度试验

按“2.1”项下色谱条件下，取绿原酸对照品溶液（浓度为40　μg/mL），每隔1小时进样1次，考察6次，每次10　μL，记录绿原酸峰面积，结果6个峰面积分别为920.466　43、924.259　76、926.059　89、919.989　66、916.451　37、915.254　75；RSD　=　0.46%（n　=　6），实验证明，对照品溶液稳定性良好，能够满足测试要求。

2.10　含量测定

取3批样品（批号分别为110328、110507、110713），置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50　mL，照供试品溶液制备方法制备样品溶液，按“2.1”项下色谱条件下，进样量10　μL，分别测定，按外标法计算绿原酸的含量，结果测得三批样品中绿原酸的含量分别为0.532　9、0.533　6、0.533　5　mg/粒。

3　讨论

医疗机构制剂是指医疗机构根据本单位临床需要而常规配制、自用的固定处方制剂。是对现代制药工业制剂不足的有效补充，是医院临床用药的组成部分，尤其是一些传统的中药古方、秘方、验方，更是民族的瑰宝；其质优价廉深受欢迎，然而其质量标准与国家药品标准相差甚远，为了保证临床用药的需要、保障患者用药安全有效，提高医院制剂质量标准、保证患者用药安全是一项紧迫任务。珍杞降糖胶囊由9味药材加工制成，处方工艺复杂，为了较好地控制该制剂的质量，经参考有关文献[2-4]及《中华人民共和国药典》（简称《药典》）2010年版一部方法，本文运用高效液相色谱法，考察了3批样品，实验证明本法操作简便、专属性强、回收率好，可用于该制剂的含量测定。

3.1　流动相选择

本试验曾用乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90）[5]，乙腈-0.4%磷酸（8∶92）[6]，甲醇-0.2　mol/L磷酸二氢钠溶液（用磷酸调节pH至3.2）（25∶75）[7]等几种流动相作比较，结果显示主成分峰出峰效果均不理想，而采用乙腈-0.4%磷酸（17∶83）为流动相，色谱峰显示，绿原酸与相邻的组分分离度大于1.5，具有较好的分离效果，且理论板数较高。

3.2　提取方法的选择

由于绿原酸极不稳定且极性较大，笔者参考《药典》并结合指标成份的理化性质，比较了加热回流提取和超声提取两种方法，发现超声提取较为完全且不影响指标成份的分解，利于控制该制剂的质量。

3.3　提取溶剂的选择

笔者发现以50%甲醇为溶剂测定含量，比用甲醇为溶剂所得的含量高，稳定性好。

[参考文献]

[1] 国家药典委员会.　中华人民共和国药典[S].　一部.　北京：中国医药科技出版社，2010：205-206.

[2] 周晓峰，谷铁波.　HPLC法测定清热暗疮胶囊中绿原酸的含量[J].　中国药师，2011，14（8）：1237-1238.

[3] 黄桂红，邓航，李江，等.　HPLC法测定复方感冒灵片中绿原酸的含量[J].　中国药师，2009，12（4）：539-540.

[4] 赵琪钟，李晓梅，李良昌.　HPLC法测定双黄连栓中绿原酸的含量[J].　中国药师，2009，12（6）：770-771.

[5] 莫文电，韦建桥，石天松.　高效液相色谱法测定痔炎消胶囊中绿原酸的含量[J].　中国药师，2008，11（6）：661-663.

[6] 李忠.　高效液相色谱法测定病毒清口服液中绿原酸的含量[J].　中国药师，2005，8（5）：393-394.

[7] 杜树山，沈圣民，曹杰，等.　HPLC法测定视力宝颗粒中绿原酸的含量[J].　中国药师，2010，13（1）：40-41.

（收稿日期：2012-08-20 本文编辑：袁 成）