病原微生物原位杂交检测法实验综述

摘要 原位杂交法近年来广泛用于生物和医学领域，其实验技术有很强的应用价值。阐述了病原微生物原位杂交检测法的实验地位和作用、实验课的设计思路和实验内容。

关键词 病原微生物；原位杂交；地高辛标记；实验综述

中图分类号 R446.6 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）09-0335-01

根据安庆师范学院生命科学学院课程设置情况，微生物学是主干基础学科，且学校注重学生实践技能的培养。结合生命科学前沿动态，病原微生物关系到居民生活和健康，是近年来的研究的热点。以地高辛标记的原位杂交技术，在医学、免疫学和基因组学等领域发展十分迅速，以应用性为导向，制定了该实验方案。

1 实验原理

1.1 病原微生物

病原微生物是指侵入机体后引起感染的病原体。常见的病原微生物有大肠杆菌、沙门氏菌和单增李斯特菌等。

1.2 原位核酸分子杂交技术

简称原位杂交技术。可将特定的基因或者核酸序列直接定位在染色体上，其灵敏度和敏感性高，不用提取组织核酸而且不受细胞中其他成分影响，较好地保存了细胞结构和形态。可用于外源DNA的鉴定，本实验用于定性和定位病原微生物。将细胞经适当处理后，其通透性增加，用标记好的序列已知的核苷酸单链作为探针，进入细胞，根据碱基互补配对的原则，与组织或细胞中待检测的核酸序列，发生特异性结合，形成杂合体。选择与标记物对应的检测系统，使用荧光检测或者化学显色的方法，杂交体在细胞原位形成带有颜色的杂交信号[1]。

1.3 随机引物法地高辛标记探针原理

以DNA单链为模板，合成双链的过程中，用同位素标记4种核苷酸底物中有1种，则在与模板序列配对的许多位置，会形成放射性探针；若用DIG-11-dUTP代替dTTP，则产生地高辛标记的探针。标记的探针DNA 的平均长度越长，引物的浓度越低[2]。

1.4 探针的选择

用于原位杂交的探针有RNA、ssDNA和dsDNA。如用于检测RNA样品，称为Northern杂交；如用于检测DNA样品，称为Southern杂交。根据病原微生物种类选择合适的探针，可根据探针来源和性质分为DNA 探针、cDNA 探针、RNA 探针及人工合成的寡聚核苷酸探针等[3]。探针长度一般在100～400个碱基，寡聚核苷酸探针（16～30个碱基），短核苷酸探针能自由出入细菌细胞壁，杂交效率比长探针高。

1.5 标记物的选择

标记物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等。但因同位素对人体伤害较大，近年多选取非放射性物质进行标记。本文选用地高辛标记系统[4]。

2 实验内容

2.1 实验课的目的

了解检测病原微生物的常用方法；掌握原位杂交实验原理和操作方法；了解原位杂交技术的应用。

2.2 实验材料

供试菌株为单增李斯特氏菌；供试试剂为地高辛标记及检测试剂盒；U-NIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒；DNA胶回收试剂盒。

2.3 实验步骤

2.3.1 核酸探针的制备。引物设计合成：根据单增李斯特氏菌的保守区域，设计1对引物，即P1：5′-ACAATTCATCTAG TGCGT-3′；P2：5′-CCACCTATACCAGTTGAC-3′。

2.3.2 RT-PCR扩增上述保守区域。按UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒说明，抽提单增李斯特氏菌总RNA，采用一步法RT-PCR进行扩增。琼脂糖凝胶电泳检测后，按UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明回收DN段。

2.3.3 地高辛标记该基因片段。模板DNA浓度：取回收获的DN段，用Nanodrop超微量核酸蛋白测定仪，测核酸浓度。10 ng/μg 模板DNA用双蒸水补足至16 μL。双链DNA变性成单链：98 ℃加热10 min，迅速冰浴冷却。取4 μL DiG-high Primer与变性后DNA充分混匀，并离心。37 ℃温育过夜。终止反应：加2 μL 0.2 moL/L EDTA（pH值 8.0）或65 ℃加热10 min。

2.3.4 探针标记效率与灵敏度测定。将对照DNA和标记好的探针分别按试剂盒说明进行稀释后，点样于硝酸纤维膜上，按试剂盒说明进行显色。

2.3.5 点样。将单增李斯特氏菌的菌液滴在硝酸纤维膜上进行点样。

2.3.6 细胞的固定。用4%多聚甲醛室温下固定2 h单增李斯特氏菌，用1×PBS漂洗3次，每次5 min，梯度乙醇脱水，每级5 min。用2张滤纸包住膜，置于真空干燥箱中，80 ℃固定2 h。

2.3.7 蛋白酶K消化。在单增李斯特氏菌细胞涂片上覆盖1层10 mg/L的蛋白酶K溶液，37 ℃消化10 min，PBS漂洗3次，每次5 min，然后放入4%多聚甲醛后固定5 min，PBS漂洗2次，每次5 min，2×SSC漂洗2次，每次5 min，100%乙醇脱水1 min，室温干燥。

2.3.8 杂交。预热一定体积的DiG Easy Hyb（10 mL/100 cm2膜）至杂交温度37～42 ℃。预杂交：不加探针的情况下，将膜放在杂交液中42 ℃下充分润湿30 min。再加入变性后的探针。将变性的探针加入预热的DIG Easy Hyb（3.5 mL/100 cm2）中，混匀。加入探针和DIG Easy Hyb混合液，42 ℃下杂交过夜。洗去多余的探针：新鲜配置40 ℃，2×SSC，洗2次，每次5 min。0.5×SSC洗1次，温和振荡15 min。

2.3.9 封闭。加入马来酸缓冲液浸泡5 min。再加入封闭液温育30 min，使抗体非特异性位点饱和。

2.3.10 中止反应。稀释抗体-DIG-抗原偶联物至150 mU/mL，滴加至膜上，37 ℃ 60 min。用100 mL 洗液洗膜15 min，洗2次。在10 mL新鲜配制的颜色底物中处理膜5 min，勿摇动，于暗处保存。当预期的斑点出现时，可在50 mL水中洗膜5 min中止反应。采集结果图像。

3 实验结果

单增李斯特氏菌基因片段的RT-PCR扩增：产物进行琼脂糖电泳时，出现500 bp左右条带，与预期的扩增片段大小一致。地高辛标记效率与灵敏度检测：对照DNA和标记探针颜色深度相似，表明探针标记的效率合格。单增李斯特氏菌禽流感病毒细胞内原位杂交：未加探针的对照细胞也没有出现阳性信号，加探针的单增李斯特氏染色清晰，结构完整。

4 注意事项

标本的固定条件、标本组织蛋白质的消化程度很重要，一定要用蛋白酶K充分消化，去除与核酸结合的蛋白质和杂蛋白，从而使DNA分子充分暴露出来，才能提高结合效率，增加杂交的效率。若固定不充分，杂交时探针不能穿过细胞，会留下未结合的探针，出现很强的背景信号，或者与其他微生物发生非特异性结合，出现假阳性[5]。靶序列的拷贝数：提高目标序列的拷贝数，若拷贝数过低则会导致荧光信号弱或者不产生。荧光染料对光敏感，图像采集前，应避免见光[6]。

5 参考文献

[1] 王玲，宁顺斌，宋运淳，等.荧光原位杂交技术的发展与应用[J].植物学报，2000，42（11）：1101.

[2] HERRINGTON C S，GRAHAM A K，MCGEE O D.Inter-phase cytogenetics using biotin and digoxigenin labelled probes. III. Increased sensitivity and flexbility for detection HPV in cervical biopsy specimens and cell lines[J]. J Clin Pathol，1991（44）：33.

[3] THISSE C，THISSE B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos[J].Nat Protoc，2008，3（1）：59-69.

[4] 马云，张燕，孙长华，等.固定液对原位杂交的影响[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2002，11（3）：345.

[5] 吴守芝，汪宗江，李恒新，等.利用荧光素原位分子杂交检验水样中嗜肺军团菌 的研究[J].中国卫生检验杂志，2007，17（4）：609-611.

[6] 娄昆鹏，程安春，汪铭书.原位杂交在病原微生物检测中的应用[J].黑龙江畜牧兽医，2010（5）：27-29.