同型半胱氨酸对单核泡沫细胞ERO1α表达的影响

摘要：目的 探讨不同浓度Hcy对单核泡沫细胞ERO1α mRNA和蛋白表达的影响。方法 培养单核源性泡沫细胞并给予不同浓度Hcy及叶酸和维生素B12干预后，分别运用实时定量PCR和Western blot检测ERO1α mRNA和蛋白表达改变。结果 成功培养单核源性泡沫细胞并检测ERO1α mRNA水平变化发现随着Hcy浓度升高，泡沫细胞ERO1α mRNA水平呈上升趋势，且与Hcy浓度呈剂量依赖关系；同时给予叶酸和维生素B12后可明显降低ERO1α mRNA水平。泡沫细胞ERO1α蛋白表达改变与mRNA变化趋势一致。结论 ERO1α在Hcy促进单核泡沫细胞形成过程中发挥重要作用。

关键词：同型半胱氨酸；单核泡沫细胞；内质网氧化还原酶-1α

同型半胱氨酸（Hcy）是动脉粥样硬化等多种心脑血管疾病的独立危险因子，但其具体致病机制尚不清楚[1]。THP-1单核泡沫细胞是动脉粥样硬化斑块的主要细胞类型，被认为是动脉斑块形成的重要标志[2]。内质网氧化还原酶-1α（ER oxidoreduclin-1， ERO1α）是位于内质网膜上的一种黄素蛋白，其对内质网腔中蛋白合成、折叠起关键调控作用且与细胞内活性氧簇（ROS）生产密切相关[3]。研究表明Hcy可以影响细胞内过氧化及氧自由基含量等多种途径促进动脉斑块形成[4]。因此，本文主要探讨不同浓度Hcy对单核泡沫细胞ERO1α表达的影响及叶酸和维生素B12对ERO1α的干预作用，为进一步明确Hcy导致AS的发生机制提供实验依据。

1资料与方法

1.1 材料 THP-1单核细胞株（宁夏医科大学心脑血管疾病重点实验室）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，中国）；CO2培养箱（Heraeus，德国）；5415D型微量台式离心机（Eppendorf，德国）；荧光定量PCR仪（上海枫岭生物技术有限公司，中国）；垂直电泳仪（Bio-Rad公司，美国）；HyClone RPMI-1640培养基（Thermo）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；Hcy（Sigma）；RNA提取试剂盒（北京天根生物技术有限公司）；cDNA逆转录和qRT-PCR试剂盒（美国Invitrogen公司）；蛋白提取试剂盒 （南京凯基生物科技发展有限公司）；ERO1α兔抗人一抗（Abcam公司），辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗（北京博奥森生物技术有限公司）；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 THP-1单核泡沫细胞培养与分组 在THP-1单核细胞培养瓶中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置37℃、5%CO2培养箱，传代培养，以4×106/ml个细胞接种于25 cm2培养瓶，加入PMA使其终浓度为100 nmol・L-1，37℃、5%CO2培养48 h，显微镜下观察细胞贴壁状态，形状不规则并有伪足伸出，证实THP-1单核细胞已分化为巨噬细胞。弃去旧培养液，更换为含终浓度50 mg・L-1 ox-LDL的不同浓度Hcy的RPMI-1640培养基继续培养24 h，观察泡沫细胞形成并用于后续实验。分组以0 mol・L-1 Hcy泡沫细胞为对照组，不同浓度Hcy（50、100、200、500 mol・L-1）和500 mol・L-1 Hcy+叶酸+维生素B12（500+F+V）干预泡沫细胞，每组3瓶。

1.3 泡沫细胞油红O染色 将干预后的泡沫细胞用PBS缓冲液洗3次，10%多聚甲醛固定10 min，60%乙醇浸泡1 min，油红O染色10 min，60%异丙醇分色3 min，双蒸水洗5 min，苏木素染色1 min，双蒸水洗待干后用水性封固剂封片，显微镜下观察，细胞内脂质呈红色，细胞核呈蓝色。

1.4 实时定量PCR检测ERO1α的mRNA水平 按照RNA提取试剂盒说明书提取细胞RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。按逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA；采用Primer5.0软件设计人ERO1α引物，引物序列为上游：5'-ATCCTTTGGCTTCTGGTCAAG-3'，下游：5'-GTTGTGTCCCCATTTCTTTTC T-3'；以人GAPDH为内参；上游：5'-GGTGAAGGTCG

GTGTGAACG-3'，下游：5'-CTCGC TCCTGGAAGATGGTG-3'；PCR条件：94℃预变性10 min，94℃变性30 s、58℃退火30 s、72℃延长30 s，扩增40个循环。待反应结束后，结合扩增曲线及溶解曲线，选择符合要求的qRT-PCR原始数据，结果用2-CT法分析。

1.5 Western blot检测ERO1α的蛋白表达改变 细胞裂解法提取各组细胞蛋白，取总蛋白20μL，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，80V 30min，120V 60min，15V恒压转膜10min，与ERO1α特异性一抗37 ℃温育2h，4 ℃过夜；与二抗（含HRP标记的羊抗兔IgG）室温孵育1.5 h后，加入显色底物。以β-actin为内参，凝胶成像分析仪上成像分析，计算ERO1α与β-actin灰度值的比值，进行分析。

1.6 统计分析 采用Prism 5.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料以（ x±s）表示，多个样本均数间比较采用单因素方差分析，P

2结果

2.1泡沫细胞鉴定 油红O染色后光镜下可见细胞内有大量的红色脂质颗粒存在，且个别细胞由于吞噬的脂滴过多而使体积增大，符合泡沫细胞的形态学特征。

2.1 不同浓度Hcy干预泡沫细胞后ERO1 mRNA表达变化 使用0、50、100、200、500 μmol・L-1不同浓度Hcy干预泡沫细胞后，检测ERO1α mRNA水平变化发现，Hcy可以增加泡沫细胞ERO1α mRNA表达水平，且随着Hcy浓度增加，ERO1α表达增多（P

2.2 不同浓度Hcy干预泡沫细胞后ERO1蛋白表达变化 使用不同浓度Hcy干预泡沫细胞后，检测ERO1α 蛋白水平变化发现，与0 μmol・L-1组比较，Hcy可以增加泡沫细胞ERO1α蛋白表达，且随着Hcy浓度增加，ERO1α表达增加（P

3讨论

大量的临床和流行病学证据表明同型半胱氨酸（Hcy）是动脉粥样硬化的独立危险因子。Hcy致动脉粥样硬化的可能机制包括氧化应激反应增强，NO的生物活性降低导致内皮功能失调，促进平滑肌细胞增殖，促进脂蛋白氧化和血小板活化，泡沫细胞在内皮下聚集，增强凝血作用，以及增加肝细胞胆固醇的合成等[5]。Hcy 作为蛋氨酸的中间代谢产物，含有活泼的自由巯基（-SH），极易发生自身氧化，生成超氧化物、过氧化氢和羟基自由基等多种强氧化物，导致机体氧化还原态失衡，启动脂质过氧化链式反应而损伤细胞，加速细胞内低密度脂蛋白（LDL）氧化成为ox-LDL，促进巨噬细胞吞噬ox-LDL 形成泡沫细胞[6]。然而，Hcy如何促进体内过氧化物质产生及堆积的分子机制仍不清楚。我们的研究结果为这一问题给出了可能的解释：Hcy可以促进单核泡沫细胞ERO1α表达增加，且与Hcy浓度改变呈剂量依赖关系。

内质网氧化还原酶l （ERO1α）是ER腔内氧化当量的重要来源，主要维持ER内氧化状态。同时EROlα激活也是细胞内活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）产生的重要来源。尤其在大量分泌蛋白质时，经粗略估算超过25%的ROS是在蛋白质分泌时产生的，当ROS的产生超过抗氧化防御能力的时候，过多的ROS会影响细胞内氧化还原稳态，产生氧化应激等损伤反应[7]。因此，ERO1α可能在Hcy促进单核泡沫细胞形成，体内氧化物质堆积中发挥重要作用，这位我们进一步研究Hcy的致病机制提供的重要线索。

叶酸和维生素B12作为Hcy代谢的辅助因子在体内发挥重要作用。叶酸和维生素B12缺乏可明显升高Hcy水平。已经证实叶酸治疗在降低血浆Hcy水平的同时，还具有独立的抗氧化作用，而且能够增加NO合酶的活性，这些都能抑制早期动脉粥样硬化的形成[8]。在Hcy促进泡沫细胞形成过程中，同时给予叶酸和维生素B12后可以降低ERO1α表达，这进一步说明了ERO1α在Hcy引起的氧化损伤中发挥重要作用。

综合以上实验结果，我们分析了ERO1α在Hcy诱导的单核泡沫细胞形成中发挥重要作用，且其可能是调控细胞过氧化的重要调控基因，这为我们进一步认识Hcy致动脉粥样硬化硬化提供了新的线索和干预靶点。

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