同型半胱氨酸血症对大鼠骨折愈合的影响

[摘要] 目的:研究并分析高同型半胱氨酸血症与骨折愈合的关系。方法:将24只大鼠随机分为两组,其中一组大鼠喂食同型半胱氨酸(HCY)加标准饮食作为实验组(12只),而另一组进行标准饮食喂养作为对照组(12只)。闭合股骨骨折坚强固定4周后,处死动物并准备进行骨骼学和生物力学分析。此外,获取血液样本并评价大鼠体内同型半胱氨酸的血清浓度。结果:血液样本定量分析显示,实验组血清浓度显著增加,为(102.2±64.5) μmol/L,并导致高同型半胱氨酸血症,而对照组血液样本浓度为(2.8±1.5) μmol/L。骨生物力学评价显示同型半胱氨酸喂食的股骨骨折大鼠的抗弯刚度明显下降,为(45.5±18.2) N/mm,而对照组为(64.6±15.8) N/mm。组织学分析表明,高同型半胱氨酸血症大鼠中骨痂形成量小于对照组,但在组成成分上两组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:同型半胱氨酸补充饮食导致严重的同型半胱氨酸血症,并且影响骨折愈合的生物力学质量。

[关键词] 同型半胱氨酸;同型半胱氨酸血症;骨折愈合;生物力学

[中图分类号] R-33[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)02(b)-014-03

Influence of hyperhomocysteinemia on fracture healing of rats

QIN Jinfeng1, LI Jinku2

(1.Public Health College of Shanxi Medical University, Taiyuan 048205, China; 2.Sihe Branch of Jincheng Coal Industry Group General Hospital, Jincheng 048006, China)

[Abstract] Objective: To research and analyze the relationship between HHCY and fracture healing. Methods: 24 rats were randomly divided into two groups, one group was fed with homocystine-supplemented diet and served as experimental group (n=12), the other group received the accordant standard diet and served as control group (n=2). Four weeks after the stable fixation of a closed femoral fracture, rats were killed to prepare bones for histomorphometric and biomechanical analysis. In addition, blood samples were obtained to evaluate serum concentration of homocysteine (HCY). Results: Quantitative analysis of blood samples revealed that the serum concentration of HCY in experimental group was (102.2±64.5) μmol/L, it was obviously increased and led to HHCY, and that of control group was (2.8±1.5) μmol/L. Biomechanical evaluation of bone repair revealed that bending stiffness of the femora of experimental group was (45.5±18.2) N/mm, and it was significantly decreased compared with that of control group of (64.6±15.8) N/mm. Conclusion: The homocystine-supplemented diet leads to severe HHCY, which is associated with an impaired biomechanical quality of the healing bone.

[Key words] Homocysteine; Hyperhomocysteinemia; Fracture healing; Rats; Biomechanics

高同型半胱氨酸血症(HHCY)是一个广泛的代谢问题,被认为是心血管疾病与骨质疏松症的危险因素[1-2]。老年人患有高同型半胱氨酸血症主要与缺陷的维生素B6、维生素B12、叶酸以及肾功能不全有关[2-5]。

近年研究表明,患有同型半胱氨酸血症的患者骨质疏松症和骨质疏松性骨折的发病率较高[6-7]。体外研究表明,同型半胱氨酸(HCY)能够刺激破骨细胞的扩散和成骨细胞的凋亡[8-12]。这可能对其他组织向骨组织的转化有不利影响,正如临床实验中对骨代谢的血清学标志物分析结果所示。

虽然已经证实同型半胱氨酸血症是骨质疏松症和骨质疏松性骨折的一个新的危险因素,但并不能说明这些代谢改变也影响骨折愈合。在高同型半胱氨酸的血药浓度下,破骨细胞的非生理增殖可能影响骨折愈合过程。因此,本实验假设同型半胱氨酸饮食所致的高同型半胱氨酸血症与骨折修复受损有关。

1材料与方法

1.1实验设计

实验组SD大鼠(体重300～400 g,12只),分别喂同型半胱氨酸,并补充标准饮食。基于先前的一项大鼠数据研究[10],大鼠喂养同型半胱氨酸,给予标准饮食3周之后制作股骨骨折模型。对照组以标准饮食喂养,3周后制作股骨骨折模型。根据对大鼠骨折愈合的研究,造模4周后处死动物,制作骨折标本并进行放射性学、组织形态学和生物力学分析。此外,采集血液样品,评价两组大鼠同型半胱氨酸的血药浓度。

1.2 造模

大鼠腹腔注射二甲苯胺噻嗪(25 mg/kg)及氯胺酮(75 mg/kg)进行麻醉。每只大鼠用三点压力装置造成右股骨骨折模型并用髓内钉固定,通过骨折碎片之间的压力在轴向与抗旋上保持骨折在术后的稳定性。根据AO原则,骨折类型为股骨干骨折A2～A3型。

1.3 血清同型半胱氨酸浓度分析

处死前,行下腔筋脉穿刺获取血液样品,放置30 min后用离心机离心分离出血清。血清标本于-80℃存放等待分析。使用气相色谱质谱法测定同型半胱氨酸的血药浓度。区域内和区间变异系数分别为3.2%和6.7%。

1.4生物力学测试

取出髓内钉后,大鼠股骨固定于三点弯曲装置。三点弯曲装置以恒速为1 mm/min、最大10 N的背转力作用于鼠股骨中心(骨折水平处)。连续监测负载和股骨形变,并绘制出负载-形变曲线。

1.5组织形态学观察

在组织形态测试中,未脱钙股骨固定于4%中性甲醛溶液中,并用乙醇脱水,最后用聚甲基丙烯酸甲酯包埋。然后沿矢状平面做薄切片(7 μm),并用甲苯胺蓝-亚甲蓝染色。组织切片在200倍光学显微镜下观察。股骨中部与边缘为被观测区域,观测目标包括骨、软骨、结缔组织和骨髓。

1.6 统计学分析

数据用均数±标准差(x±s)表示,使用SAS软件进行U检验,两两比较采用Bonferroni法,P

2 结果

2.1 X线分析

X线显示,4周内实验组大鼠与对照组大鼠内置物与骨折端无明显移位,并且骨折缝隙减少,两组大鼠骨折处均有骨痂形成。

2.2血清同型半胱氨酸浓度分析结果

喂食同型半胱氨酸补充饮食的实验组大鼠同型半胱氨酸血药浓度为(102.2±64.5) μmol/L,与标准饮食的对照组的(2.8±1.5) μmol/L比较,差异有高度统计学意义(P0.05),组间个体体重差异无统计学意义(P>0.05)。术后3 d所有个体均活动自如,行动不受限。

2.3 生物力学分析结果

骨折后4周,实验组大鼠愈伤组织的抗弯刚度为(45.5±18.2) N/mm,与对照组的(64.6±15.8) N/mm比较,差异有统计学意义(P

2.4 组织形态学分析结果

在骨折愈合的4周内所有样本显示出典型的骨折愈合模式。增生组织以编织成骨为主,并且喂食同型半胱氨酸补充饮食的实验组大鼠骨痂生成的直径小于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05),见表1。对照组大鼠中没有发现纤维软骨,但在实验组中有2只出现纤维软骨(表1),表明在骨愈合和改建过程中这2只大鼠要慢于没有表达纤维软骨的大鼠。

表1 组织形态学分析(x±s)

3讨论

实验结果验证了本研究的假说,即同型半胱氨酸饮食与骨折愈合之间存在关联。血清分析结果证明同型半胱氨酸饮食可导致高半胱氨酸血症。大鼠喂食同型半胱氨酸引起严重的高半胱氨酸血症[5],实验组同型半胱氨酸血清浓度为(102.2±64.5) μmol/L,约为对照组[(2.8±1.5) μmol/L]的40倍。迄今为止,只有少数研究使用动物模型分析同型半胱氨酸血症对骨代谢的影响。通过给大鼠喂食甲硫氨酸等[8]使其同型半胱氨酸血清浓度上升到16 μmol/L,形成温和的同型半胱氨酸血症[5]。Herrmann等[9]通过给大鼠喂食甲硫氨酸与标准饮食,可使大鼠同型半胱氨酸血清浓度达到(27.0±8.8) μmol/L,从而也形成温和的同型半胱氨酸血症。这项实验结果表明,同型半胱氨酸血症组骨折愈合组织的面积和股骨的力学强度比对照组大鼠都有不同程度的降低;也说明大鼠骨折愈合与血清高浓度同型半胱氨酸的相关性。另一项动物实验表明,在高同型半胱氨酸血症大鼠的骨组织中有同型半胱氨酸累积,并且其骨密度降低[10]。

最近在体外和体内的研究都表明,在骨吸收过程中同型半胱氨酸浓度升高[8-12]。此外,几个横断面研究已经显示出同型半胱氨酸浓度的升高和骨吸收的增加之间有明显的联系。体外研究证实在破骨细胞的活动中同型半胱氨酸含量增加[11]。另一方面,同型半胱氨酸血症影响骨代谢仍然是一个有争议的话题,因为其他研究否认同型半胱氨酸的血清浓度升高和增加骨质疏松性骨折的风险的关系。

同型半胱氨酸血症影响骨祖细胞和成骨细胞的活动,两者是骨折愈合过程中的关键细胞[1,12]。但是,关于这个问题的数据也是矛盾的。体外研究表明,低浓度的同型半胱氨酸可刺激成骨细胞,但据报道高浓度的同型半胱氨酸对成骨细胞有毒性作用[1]。

综上所述,本实验表明同型半胱氨酸饮食可导致严重的同型半胱氨酸血症,扰乱了大鼠的骨修复。改变破骨细胞和成骨细胞的增殖和活性是否能导致这一结果,对伴有同型半胱氨酸血症的骨折患者的治疗非常重要。

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(收稿日期:2009-09-22)