苦碟子对高同型半胱氨酸血症细胞凋亡的影响

[摘要] 目的 通过大鼠灌胃给予蛋氨酸复制高同型半胱氨酸血症动物模型，观察苦碟子对高同型半胱氨酸血症大鼠动脉病理变化和细胞凋亡的影响。方法 将雌性Wistar大鼠共28只随机分为模型组（n = 8）、空白对照组（n = 7）、叶酸+VitB12组（n = 7）和苦碟子组（n = 6）。除空白对照组外，其他组每天2次灌胃给予蛋氨酸0.75 g/kg，连续10周，复制高同型半胱氨酸血症动物模型。叶酸+VitB12组和苦碟子组同时给予叶酸+VitB12和苦碟子干预。检测各组大鼠血浆同型半胱氨酸、Caspase-3含量及动脉病理变化和平滑肌凋亡细胞计数。 结果 模型组大鼠灌胃给予蛋氨酸后血浆同型半胱氨酸、Caspase-3含量和平滑肌凋亡细胞计数均较空白对照组升高（均P < 0.01）；苦碟子组血浆Caspase-3含量和平滑肌凋亡细胞计数与模型组比较降低（均P < 0.01）。 结论 高蛋氨酸可诱发高同型半胱氨酸血症， 引发动脉粥样硬化。苦碟子对高同型半胱氨酸血症诱发的动脉粥样硬化具有预防作用，其机制与抑制细胞凋亡相关。

[关键词] 高同型半胱氨酸血症；凋亡；Caspse-3

[中图分类号] R589.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）03（c）-0023-02

大量研究表明，高同型半胱氨酸血症（hyperhomocystinemia， HHcy）引发动脉粥样硬化及相关心脑血管疾病的病理生理机制十分复杂[1-2]。目前，HHcy动物模型的复制有多种方法。本实验研究采用大鼠灌胃给予蛋氨酸的方法复制HHcy动物模型，检测动脉硬化的相关指标，并对叶酸+VitB12及苦碟子干预其动脉平滑肌凋亡的作用进行药效学研究。现将研究结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验动物为体重120～150 g的Wistar雌性大鼠，购于沈阳医学院实验动物中心[SCXK（辽）2003-0016，辽宁省科学技术厅签发]。动物饲料为繁殖鼠全价颗粒饲料， 由沈阳市于洪区前民饲料厂生产。VitB12，山西云鹏制药有限公司生产（批号：20061107）；叶酸，天津飞鹰制药有限公司生产（批号：20060408）；蛋氨酸粉剂，吉林农业大学提供；同型半胱氨酸（Hcy）、Caspse-3酶联免疫吸咐（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、TUNEL检测试剂盒，购于南京建成生物工程研究所；苦碟子注射液，通化华夏药业有限公司生产（批号：060506）。

1.2 实验方法

雌性Wistar大鼠28只在实验室适应性饲养1周后，随机分为4组，模型组（n = 8）给予0.75 g/kg蛋氨酸灌胃，每天2次；苦碟子组（n = 6）给予0.75 g/kg蛋氨酸灌胃，每天2次，同时给予7.5 mL/kg苦碟子注射液灌胃，每天1次；叶酸+VitB12组（n = 7）给予0.75 g/kg蛋氨酸灌胃，每天2次，同时分别给予2.5 mg/kg叶酸、10 μg/kg VitB12灌胃，每天1次；空白对照组（n = 7）每天给予等容积生理盐水灌胃。连续给药10周后将动物处死，分别取血并分离血浆，ELISA法检测血浆Hcy、Caspse-3水平。取胸主动脉并以2.5%戊二醛固定，分别在光学显微镜、电子显微镜下检查其病理改变。TUNEL法检测胸主动脉平滑肌阳性细胞计数，正常细胞核均匀着蓝绿色，凋亡细胞核呈深浅不一的棕黄色。于电子显微镜下随机选取1个视野，计数视野中血管中膜细胞TUNEL染色阳性细胞数。

1.3 统计学方法

采用SPSS 10.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与空白对照组比较，模型组大鼠血浆Hcy明显升高，TUNEL胸主动脉平滑肌阳性细胞计数增多，血浆Caspse-3含量升高（均P < 0.01），提示Wistar雌性大鼠灌胃给予蛋氨酸0.75 g/kg，每天2次，连续10周可诱发HHcy。与模型组比较，药物干预各组TUNEL胸主动脉平滑肌阳性细胞计数减少，血浆Caspse-3含量降低（均P < 0.01）。叶酸+VitB12组血浆Hcy浓度下降，与模型对照组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。光学显微镜显示：模型组大鼠血管壁的病理改变为内皮损伤，平滑肌增生，在内膜下及平滑肌有炎性细胞浸润；空白对照组大鼠血管壁未见病理改变；药物干预各组内皮损伤、血管平滑肌增生和炎性细胞浸润程度均较模型组大鼠明显减轻。电子显微镜显示：模型组大鼠病理改变为血管平滑肌细胞肿胀十分明显，内质网呈扩张状态，线粒体水肿，溶酶体明显增多；叶酸+VitB12组、苦碟子组及空白对照组均未见上述改变。

3 讨论

大量研究表明，Hcy可能是通过诱导内皮功能紊乱、血管平滑肌增生、促进脂蛋白氧化、增加血小板活性、增加胶原蛋白合成导致动脉粥样硬化[3]。近年研究表明，细胞凋亡亦是Hcy致动脉粥样硬化的机制之一，Hcy可促进内皮细胞及血管平滑肌凋亡，并且呈浓度依赖性关系[4]。在正常血管和动脉粥样硬化各个阶段血管平滑肌都存在凋亡，但动脉粥样硬化的血管平滑肌凋亡数量较正常血管明显增加[5-7]。本实验证实，Hcy可引发动脉粥样硬化促进大鼠血管平滑肌凋亡，叶酸+VitB12和苦碟子可降低血浆Caspse-3含量，抑制血管平滑肌凋亡。叶酸、VitB12抑制血管平滑肌凋亡可能与降低血浆Hcy含量进而抑制其病理过程密切相关。苦碟子对Hcy的代谢无明显影响，但对HHcy的影响是多方面的，其具有抗过氧化、抑制细胞因子异常分泌等作用[8-10]，其抑制Caspse依赖性的细胞凋亡机制可能与上述作用有关，但相关的信号传导途径有待进一步研究。

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（收稿日期：2012-11-27 本文编辑：程 铭）