与口腔黏膜病相关的假丝酵母菌代谢组学鉴定的初步研究

[摘要] 目的 分析3种假丝酵母菌的磁共振代谢物图谱，探讨用代谢组学方法快速鉴定口腔黏膜致病菌的可行性。方法 在沙保培养基中分别接种白色假丝酵母菌ATCC 10231、热带假丝酵母菌ATCC 13803和光滑假丝酵母菌ATCC 15126，绘制生长曲线，选择3种菌生长稳定期的培养液检测其磁共振图谱，用主成分分析法进行数据分析。结果 主成分分析法显示：每两种细菌在主成分得分图中有组间分散、组内聚集的特点，可以区分不同的假丝酵母菌。结论 代谢组学分析技术是一种有良好发展前景的口腔细菌快速鉴定技术。

[关键词] 代谢组学； 磁共振； 假丝酵母菌； 主成分分析

[中图分类号] R 739.86 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.018

白色假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌是正常人口腔、胃肠道、呼吸道及阴道黏膜的常见共生菌，仅能在特定条件下造成宿主感染。代谢组学是20世纪90年代中期发展起来的一门对生物体或细胞的所有低相对分子质量代谢产物进行定量和定性分析的新技术。高分辨率磁共振（nuclear ma-

gnetic resonance，NMR）可用于对细胞外微量代谢组分进行检测，得到相应的代谢图谱，使用先进的软件分析方法可以正确地归类处理这些图谱。本研究对与口腔黏膜病相关的3种假丝酵母菌的代谢图谱进行比较，用主成分分析法（principal components ana-lysis，PCA）进行分析，探讨用该方法寻找特征性产物来鉴定假丝酵母菌的可行性。

1 材料和方法

1.1 实验菌株及实验仪器

白色假丝酵母菌ATCC 10231、热带假丝酵母菌

ATCC 13803、光滑假丝酵母菌ATCC 15126（上海川翔生物科技有限公司）；CH-2生物显微镜（Olympus公司，日本），分光光度计（上海尤尼卡公司），高

速低温离心机（Jouan公司，法国），-80 ℃低温冰箱（Heto Ultra公司，美国），磁共振仪（Bruker公司，德国）；重水（上海楚柏实验室设备有限公司）；分析软

件SIMCA-P 11.0（Umea公司，瑞典）。

1.2 生长曲线的绘制

将白色假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌解冻，增菌48 h，经显微镜形态学检查及科玛嘉显色培养基鉴定为纯培养后，分别将3种假丝酵母菌接种于沙保培养基，培养48 h，用分光光度计调整菌悬液吸光度值为1.00±0.05备用。在9支试管中分别加入沙保培养液4.5 mL，在每支试管中加入白色假丝酵母菌菌悬液50 μL，同法将热带假丝酵母菌及光滑假丝酵母菌菌悬液50 μL分别加入9支试管中，各试管在37 ℃、200 r·min-1摇床行增菌培养，在3、6、9、12、24、36、48、60、72 h各取1支，旋涡振荡器混匀30 s，分光光度计测量菌悬液吸光度值，以纯沙保培养液作阴性调零，测定3种假丝酵母菌的菌悬液密度。将实验重复3次，取每个时间点的平均值，以时间（h）为横坐标，以OD600值为纵坐标绘制生长曲线。

1.3 测试样本的制备

分别取3种假丝酵母菌生长稳定期（培养36 h）的培养液于4 ℃、10 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液1 mL，加0.5 mL磷酸盐缓冲液（2.4 g·L-1 KH2PO4，

8 g·L-1 Na2HPO4，7.2 g·L-1 NaCl），混匀后静置10 min，以相同条件（4 ℃、10 000 r·min-1）离心10 min，吸取上清液用0.22 μm滤纸过滤，取1.35 mL滤液，加入重水0.15 mL，混匀后将样品移入核磁管中（每管1.5 mL），置于-80 ℃低温冰箱保存，NMR测定前解冻并保持在0 ℃左右。

1.4 1H-NMR图谱的采集和处理

将核磁管放入磁共振仪中进行1H-NMR谱扫描，样本的扫描温度设置为295 K室温。采用磁共振仪专用参数，包括采集点数32×1 024，累加次数128次，每个样本扫描后均收集到131 072个数据点，波宽为7 788.162 11 Hz，每个样本扫描2～3 min，将得到的15个原始的自由感应衰减信号（free induction decay，

FID）输入MestReC软件进行傅里叶转换（Fourier tran-sition，FT），并进行相位调整和基线调整，获得相位满意、基线平整的1H-NMR图谱。调用软件的积分工具，除去水峰所在区间，并对1H-NMR谱进行分段积分，其中每个FID信号有200个积分值。将每个样本的积分值导入Excel表中备用。

1.5 数据分析

用PCA进行数据分析。用SIMCA-P 11.0软件对200个积分值进行化学计量上的处理，以主成分矢量为坐标轴作二维图，即得分图，从而对不同的菌悬液进行分析，找出类别间的差异所在。

2 结果

2.1 3种细菌的生长曲线

3种假丝酵母菌的生长曲线见图1。由图1可见，3种菌的生长规律相似，36～48 h生长繁殖达到高峰，处于稳定期，48 h后处于衰亡期。选择生长稳定期（36 h）的代谢物测1H-NMR图谱。

2.2 1H-NMR图谱的测定结果

图2为白色假丝酵母菌、热带假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌的1H-NMR图谱，3种菌的氢谱轮廓相似，其代谢物集中在化学位移值为3.5×10-6和1.0×10-6附近，每种菌代谢物集中出现区域的波谱形态与强度并不完全一样，但通过单纯的1H-NMR图谱无法清楚准确地区分3种菌。

2.3 PCA结果

以不同假丝酵母菌代谢物主成分矢量为坐标轴做出的PCA得分图见图3～5，可见不同数据有组间离散、同类数据有组内聚集的特点。白色假丝酵母菌散点图内部有较好的聚集，与热带假丝酵母菌的得分图没有混杂（图3）。白色假丝酵母菌相对于光滑假丝酵母菌的散点图团聚性更好，可以很好地与光滑假丝酵母菌区分开，且散点图均位于95%的可信区间内（图4）。热带假丝酵母菌与光滑假丝酵母菌各自

的团聚性很好，不同细菌没有混杂（图5）。

3 讨论

近年来，随着广谱抗生素的滥用，肾上腺皮质激素、细胞毒性药物和放射治疗的广泛应用，口腔假丝酵母菌性损害日益增多。Shen等[1]在研究中国老

年人根面龋细菌学时指出，白色假丝酵母菌检出率高达63.33%。Gbris等[2]认为，白色假丝酵母菌是龋病的危险因素之一，其数量与龋有很强的相关性。由此可见，分离和快速鉴定假丝酵母菌有很重要的临床意义。在假丝酵母菌性损害中，最常见的是白色假丝酵母菌，其毒力最强。近年来光滑假丝酵母菌检出率也逐渐增高，且对氟康唑等抗真菌药物并不敏感，需要在临床中加以区分，以选择不同的治疗方案。本实验采用代谢组学鉴定法对3种假丝酵母菌进行分析鉴定，结果发现：基于NMR的代谢组学及一系列化学计量学和多元统计学方法可以区分不同的假丝酵母菌。

近年来，代谢组学在疾病诊断，植物、微生物研究中均有大量的文献出现。作为一门研究生物体内源性代谢物整体及其变化规律的学科，代谢组学实际上是分析化学、化学计量学和生命科学的交叉学科。它利用了分析化学的各种谱学技术，包括磁共振波谱、质谱、色谱、红外和拉曼光谱等进行研究。本研究的方法是常用的磁共振波谱，通过磁共振波谱获得海量、多维的数据后进行正确的分析是本研究的关键步骤。

PCA是最常用的分析方法，是将分散于一组变量上的信息集中于几个综合指标上，发挥了数据降维分析的作用，避免淹没于大量数据中[3]。从PCA得分图可观察样品的集聚或离散程度。样品分布点越靠近，说明这些样品中所含有的变量和/或分子的组成和浓度越接近；反之，样品分布点越远离，其差异越大；因此，得分图也可以更形象地称为样品分布散点图。本实验中，3张散点图中不同的细菌无交叉，同一细菌间有聚集趋势。在光滑假丝酵母菌与热带假丝酵母菌的散点图中，数据呈现出很好的团聚性。PCA也存在一些问题，由于实验的操作因素或样本本身的原因经常会有离群样本点存在，这会严重影响聚类结果[4]和生物标志物的寻找结果。此

外，同一细菌的不同代谢物可能有较明显的尺度差异，主成分的选择会受到浓度较大组分的影响[5]，一

些浓度小的代谢组分的影响通常体现不出来，而这些小浓度组分往往有很重要的生物学意义。本实验也发现，在同一张散点图中，光滑假丝酵母菌相对于白色假丝酵母菌的散点图更加分散。在后续的研

究中，笔者认为，应该摸索如何用尺度同一化的方法进行数据预处理来消除数据的尺度差异。

经典的微生物分类方法多根据微生物形态学以及对不同底物的代谢情况进行表型分类。随着分子生物学的发展，基因型分类法得到了广泛应用，但是，某些菌株按照表型与基因型两种方法分类时会得出不同的结果。在这种情况下，代谢谱分析法逐渐成为一种快速、高通量、全面的表型分类方法[6]。该方法可通过检测细胞外代谢物进行鉴别，与现有其他细菌鉴定方法相比较，基于NMR的代谢组学技术具有样品处理简单、用量少（只需10 mg）、测定快

速（只需5 min）、无侵入性、不破坏样品的结构性质

等优点，可作为常规细菌鉴定分类方法的有益补充。

[参考文献]

[1] Shen S， Samaranayake LP， Yip HK， et al. Bacterial and yeast flora

of root surface caries in elderly， ethnic Chinese[J]. Oral Dis， 2002，

8（4）：207-217.

[2] Gbris K， Nyrasdy I， Bnóczy J. Significance of assessing risk

factors for caries in their prevention[J]. Orv Hetil， 2002， 143（24）：

1467-1473.

[3] Waters NJ， Holmes E， Waterfield CJ， et al. NMR and pattern re-

cognition studies on liver extracts and intact livers from rats treated

with alpha-naphthylisothiocyanate[J]. Biochem Pharmacol， 2002， 64

（1）：67-77.

[4] Nicholson JK， Connelly J， Lindon JC， et al. Metabonomics： A plat-

form for studying drug toxicity and gene function[J]. Nat Rev Drug

Discov， 2002， 1（2）：153-161.

[5] Urbanczyk-Wochniak E， Luedemann A， Kopka J， et al. Parallel

analysis of transcript and metabolic profiles： A new approach in

systems biology[J]. EMBO Rep， 2003， 4（10）：989-993.

[6] Bundy JG， Willey TL， Castell RS， et al. Discrimination of patho-

genic clinical isolates and laboratory strains of Bacillus cereus by

NMR-based metabolomic profiling[J]. FEMS Microbiol Lett， 2005，

242（1）：127-136.