封闭肠环法用于葛根多成分肠壁吸收代谢研究

[摘要] 中药生物药剂学分类系统在药物溶解性和渗透性研究的基础上，强调中药的多成分环境特点。该文采用封闭肠环法，同时结合液质联用技术对葛根水提液多成分肠吸收代谢情况加以研究分析，为中药多成分的生物药剂学分类系统渗透性评价方法提供遴选依据。结果在葛根水提液中推测并鉴别出36个成分，其中17个成分可在血浆样品中检测到，表明其可以吸收入血，可初步作为中药生物药剂学分类系统中肠渗透性评价成分；另外有19个成分未在血浆样品中检测到，表明其可能未吸收或与肠壁酶结合、代谢。

[关键词] 多成分；吸收代谢；液质联用

Intestinal absorption and metabolism of Puerariae Lobatae

Radix decoction by in situ closed-loop method

MA Xiao-yun1， LIU Yang1， YANG Rui-rui1， LUO Zhi-qiang1， LU Li-na1，

ZHAO Hai-yu2， ZHAO Hui-hui1*

（1. Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China；

2. Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700， China）

[Abstract] Biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica （CMMBCS） emphasizes characteristic of the multi-component environment based on the drug solubility and permeability. In this study， the in situ closed-loop method combined with LC-MS technique was utilized to study the intestinal absorption and metabolism of Puerariae Lobatae Radix decoction （PLRD）， providing selection basis for intestinal permeability components in CMMBCS. A total of 36 components were identified from PLRD. Among them， 17 components could be detected in the plasma sample， indicating that 17 components could be absorbed into blood， so these 17 components could be used as intestinal permeability evaluation components in CMMBCS. The other 19 components were not detected in the plasma sample， suggesting that they may not be absorbed or metabolized by the gut wall enzymes.

[Key words] multi-component drug； absorption and metabolism； LC-MS

口服中药的多成分在进入体循环前，需要经历复杂的生物转化过程。肠吸收屏障网络作为机体的第一重保护系统的同时，也是限制药物吸收的主要因素。首先肠黏膜上皮细胞及表面覆盖的黏液物对药物极性及大小的选择性构成了吸收的第一道物理屏障[1]；其次胃肠道中的酸碱消化液、消化酶等往往会引起某些不稳定成分的降解；而肠上皮细胞的代谢酶及肠道外排转运蛋白的存在可能会极大地影响药物吸收[2]。

生物药剂学分类系统（biopharmaceutics classification system，BCS）的概念于1995年提出[3]，用于判断药物在口服吸收时是否出现生物利用度的问题，并对药物制剂体内外相关性作出合理性预测，自提出以来，受到广泛关注与重视[4]。体内环境的复杂性导致生物药剂学分类属性变化机制的多样性，对此近年来有学者就胃肠液pH、缓冲能力、腔体积等的影响因素提出对Ⅱ，Ⅳ类药物的次级分类（酸性、碱性、中性）[5]，更为科学地阐明了体内溶解度预测方法学的机制。中药生物药剂学分类系统[6]在BCS基础上，强调中药的多成分环境特点，然而因物理屏障、代谢酶及外排转运蛋白等的存在，并不是中药中所有成分均能被吸收，已有研究表明肠壁代谢影响中药多成分吸收[7-8]。研究肠壁对中药多成分的影响有助于厘清引起多成分渗透性变化的作用机制，进而明确评价多成分渗透性的方法选择依据。

葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata （Wild.）Ohwi的干燥根。研究表明葛根中异黄酮类成分具有广泛的药理作用[9]。目前对葛根的吸收代谢研究多见于单个成分[10-11]，未见其整体多成分肠吸收的评价报道。本研究运用在体封闭肠环法结合液质联用技术，定性分析成分结构，同时检测入血成分，明确其吸收情况，为葛根中复杂多成分渗透性评价方法选择提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Thermo UHPLC-LTQ-Orbitrap MS/MS液质联用仪（美国赛默飞世尔科技有限公司），包括Ultimate 3000高效液相色V仪，自动进样器，DAD检测器，柱温箱，二元泵和LTQ Orbitrap质谱；Xcalibur，Metworks和 Mass Frontier 7.0数据采集和处理系统；BT 25S赛多利斯分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；电热恒温水浴锅（DZKW-4，北京中兴伟业仪器有限公司）；QL-901漩涡混合机（其林贝尔仪器制造公司）；1-15PK离心机（德国Sigma公司）；蠕动泵（BT-100-1F，保定兰格恒流泵有限公司）。

1.2 药品与试剂

对照品：鹰嘴豆芽素A（批号MUST-16030604）、染料木苷（批号MUST-13080501）均购自成都曼思特生物科技有限公司，染料木素（批号G106672）；大豆苷元（批号G109561）购于上海晶纯生化科技股份有限公司；葛根素（批号20130310）、大豆苷（批号20130728）购于上海源叶生物科技有限公司，所有对照品纯度均≥98%。葛根片购自于北京同仁堂药店，药材经北京中医药大学张贵君教授鉴定，为豆科植物野葛P. lobata的干燥根，甲醇、乙腈（色谱纯，Fisher公司），娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司），其余试剂均为市售分析纯。

1.3 动物

SD大鼠，雄性，体重280～330 g，斯贝福（北京）实验技术有限公司提供，许可证号SCXK（京） 2011-0004，动物饲养于北京中医药大学实验动物部标准屏障环境内，实验前适应性喂养大鼠1周以上，自由饮食，明暗节律12 h/12 h。

2 方法

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液的制备 分别精密称取适量的鹰嘴豆芽素A、染料木苷、染料木素、大豆苷元、大豆苷、葛根素对照品于置于10 mL量瓶中，70%甲醇溶解稀释至质量浓度约为10 mg・L-1的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 称取葛根25 g，混合，加12倍量蒸馏水煎煮1 h，趁热过滤，药渣加入10倍蒸馏水再煎煮1 h，趁热过滤，合并2次滤液，滤液浓缩至1 g・mL-1，作为样品储备液，4 ℃保存备用。

2.1.3 样品分析 精密量取上述葛根提取液适量于10 mL的量瓶中，甲醇稀释成质量浓度为10 g・L-1的药液。取适量的药液于离心管中，12 000 r・min-1高速离心后UHPLC-MS进样分析。

2.2 动物手术

封闭肠环实验 6只SD大鼠禁食12 h，自由饮水，分为2组，4只为供血组，1只为实验组，腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，供血组腹主动脉取血，血液混合置于肝素化离心管置于37 ℃水浴锅中保温，用于实验组大鼠血液供给与空白血取样。固定实验组大鼠于加热鼠板上，颈静脉插管用于输血；沿其腹缝线打腹腔约3～4 cm，选取空肠肠系膜静脉插管用于收集血液；结扎肠系膜上腔静脉总管，截取空肠肠段10 cm，用温热的生理盐水冲洗干净，注入1 g・mL-1药液5 mL，结扎。通过蠕动泵维持血液供给与采集，采集30 mL。

2.3 血液样品处理及分析

含药血液及空白血4 000 r・min-1离心10 min，取上清液，加入3倍量甲醇，涡旋2 min，4 000 r・min-1离心10 min，取上清液，40 ℃氮吹至干，300 μL甲醇复溶，12 000 r・min-1离心10 min，UHPLC-MS进样分析。

2.4 色谱条件

Thermo Bos Hypersil C18（2.1 mm×150 mm，2.4 μm）色谱柱；流动相：A相0.1%甲酸水，B相乙腈；梯度洗脱（0～15 min，3%～25% B；15～22 min，25%～40% B；22～30 min，40%～90% B；30～32 min，90% B）；流速0.3 mL・min-1；柱温35 ℃，进样量3 μL。

2.5 质谱条件

采用电喷雾电离离子源（ESI），正负离子分别检测，喷雾气压344.74 kPa，干燥气（N2）流速5 L・min-1，干燥气温度330 ℃，气化室温度350 ℃，毛细管电压4 kV，电晕放电电流4.0 μA，破碎电压（Fragmentor）100 V，扫描范围m/z 100～1 000。

3 结果

3.1 葛根水提液中多成分液质联用分析

采用2.4项下的色谱条件能够对混合对照品及葛根水煎液中的成分实现较好的分离，见图1，2，对质谱图进行分析，结果表明葛根水煎液中主要为以大豆苷元及其甲基化羟基化物为基本结构的异黄酮类成分。通过精确化合物相对分子质量信息偏差在5×10-6以内计算其可能的元素组成，根据二级碎片信息、文献报道数据、保留时间及对照品对照推测并鉴定出葛根水提液中36个化学成分，结果见表1。

化合物1一级质谱分子离子峰为m/z 595 [M+H]+。二级质谱中存在m/z 433[M+H-C6H11O5]+，313[M+H-C6H11O5-C4H8O4]+等碎片离子，结合文献[12]报道，推测该化合物3′-hydroxy-4′-O-β-D-glucosylpurerarin。

化合物2，4，7，12，30一级质谱具有相同的分子离子峰m/z 579[M+H]+，化合物4二级质谱中存在碎片峰m/z 417[M+H-C6H11O5]+，255[M+H-C6H11O5-C6H11O5]+，结合文献[12]报道，推测该化合物为daidzein7，4′-O-diglucoside；化合物30二级质谱中存在m/z 447[M+H-C5H8O4]+，285[M+H-C5H8O4-C6H11O5]+，结合文献[12]报道，推测该化合物为5，7-dihydroxy-4′-methyloxyisoflavone 7-O-[apiofuranosyl-（16）] glucopyranoside；化合物2，7二级质谱中存在m/z 417[M+H-C6H11O5]+，297[M+H-C6H11O5-C4H8O4]+，且二者碎片信息基本一致，结合文献[12]报道，推测两化合物为puerarin-4′-O-glucoside或puerarin-7-O-glucoside，化合物12二级质谱中存在m/z 447[M+H-C5H8O4]+，327[M+H-C5H8O4-C4H8O4]+，结合文献[12]报道，推测该化合物为4′，7-dihydroxy-3′-methoxyisoflavone 8-C-[β-D-apiofuranosyl-（16）]-glucopyranoside。

化合物3一级质谱分子离子峰为m/z 711 [M+H]+，二级质谱中存在m/z 579[M+H-C5H8O4]+，417[M+H-C5H8O4-C6H10O5]+，297[M+H-C5H8O4-C6H10O5-C4H8O4]+，结合文献[12]报道，推测该化合物为mirificin4′-O-glucoside。

化合物5，17一级质谱具有相同的分子离子峰m/z 433[M+H]+，化合物5二质谱中存在m/z 313[M+H-C4H8O4]+，结合文献[12]报道，推测该化合物为3′-hydroxypuerarin，化合物17二级质谱中存在m/z 271[M+H-C6H10O5]+，且保留时间、质谱数据与染料木苷对照品一致，故该化合物为genistin。

化合物6，15一级质谱具有相同的分子离子峰m/z 565[M+H]+，且两者二级质谱中均存在m/z 433[M+H-C5H8O4]+，313[M+H-C5H8O4-

C4H8O4]+，结合文献[12，14-15]报道及其相对保留

时间，推断6，15化合物分别为3′-hydroxy-daidzein 8-C-apiosyl（16）glucoside，genistein8-C-apiofuranosyl（16）glucoside。

化合物8，13一级质谱具有相同的分子离子峰m/z 413[M+H]+，其中化合物8二级质谱中存在m/z 297[M+H-C4H8O4]+，且保留时间、质谱数据与葛根素对照品一致，故该化合物为puerarin，葛根素的质谱裂解途径见图3；化合物13二级质谱中存在m/z 255[M+H-C6H10O5]+，且保留时间、质谱数据与大豆苷对照品一致，故该化合物为daidzin。

化合物9，11一级质谱具有相同的分子离子峰m/z 549 [M+H]+，二级质谱中均存在m/z 417[M+H-C5H8O4]+，297[M+H-C5H8O4-C4H8O4]+，且二者碎片信息基本一致，结合文献[12-13]报道，推测2化合物为mirificin或puerarinxyloside。

化合物10，14，31一级质谱具有相同的分子离子峰m/z 447[M+H]+，其中化合物10二级质谱中存在m/z 327[M+H-C4H8O4]+，结合文献[14]报道，推测该化合物为3′-methoxypuerarin，化合物14，32二级质谱中均存在m/z 285[M+H-C6H10O5]+，但化合物14的m/z 285[M+H-C6H10O5]+碎片峰经RDA裂解产生m/z 137的碎片峰，而化合物32的m/z 285[M+H-C6H10O5]+碎片峰经RDA裂解产生m/z 152的碎片峰，结合文献[12]报道，推测化合物14为3′-methoxydaidzin，化合物31为5-mydroxyononin。

化合物16一级质谱分子离子峰为m/z 463[M+H]+，二级质谱中存在m/z 445[M+H-H2O]+，427[M+H-H2O-CO]+，结合文献[13]报道，推测该化合物为tectoridin。

化合物18一级质谱分子离子峰为m/z 475[M+H]+，二级质谱中存在m/z 313[M+H-C6H10O5]+，219[M+H-C6H10O5-C6H6O]+，结合文献[12-13]报道及分子结构特征，推测其为pueroside C或pueroside D。

化合物19，20一级质谱具有相同的分子离子峰m/z 563[M+H]+，二级质谱中均存在431 m/z[M+H-C5H8O4]+，311[M+H-C5H8O4-C4H8O4]+，二者碎片信息基本一致，结合文献[12-13]报道，推测两化合物为formononetin 8-C-[β-D-apiofuranosyl-（16）]-β-D-glucopyranoside或formononetin 8-C-[β-D-xylopyranosyl-（16）]-β-D-glucopyranoside。

化合物21一级质谱分子离子峰为m/z 503[M+H]+，二级质谱中存在m/z 255 [M+H-C9H12O8]+，结合文献[13]报道，推测该化合物为6″-O-malonyldaidzin。

化合物22一级质谱分子离子峰为m/z 459[M+H]+，二级质谱中存在m/z 255 [M+H-C8H12O6]+，结合文献[13]报道，推测该化合物为6″-O-acetyldaidzin。

化合物23一级质谱分子离子峰为m/z 475[M+H]+，二级质谱中存在m/z 313[M+H-C6H10O5]+，219[M+H-C6H10O5-C6H6O]+，结合文献[12-13]报道及分子结构特征，推测该化合物为pueroside C或pueroside D。

化合物24一级质谱分子离子峰为m/z 431[M+H]+，且二级质谱中均存在m/z 269[M+H-C6H10O5]+，结合文献[13]报道，推测该化合物为ononin。

化合物25一级质谱分子离子峰为m/z 255[M+H]+，且二级质谱中存在m/z 227[M+H-H2O]+，199[M+H-H2O-CO]+，137[M+H-C8H6O]+，保留时间、质谱数据与大豆苷元对照品一致，故该化合物为daidzein。

化合物26，29，36一级质谱具有相同的分子离子峰m/z 285[M+H]+，化合物26二级质谱中存在m/z 137 [M+H-C9H8O2]+，结合文献[13]报道，推测该化合物为3′-methoxydaidzein；化合物29，36二级质谱均存在m/z 152 [M+H-C8H6O]+，化合物36质谱数据、保留时间与鹰嘴豆素A对照品一致，故化合物36为biochanin A，根据异黄酮化合物结构及裂解特征，推测化合物29为6，8-hydroxy-formononetin。

化合物27，32一级质谱具有相同的分子离子峰m/z 271[M+H]+，化合物27二级质谱存在m/z 137 [M+H-C8H6O2]+，结合文献[13]报道，推测该化合物为3′-hydroxydaidzein，而化合物32二级质谱存在m/z 152 [M+H-C8H6O]+的分子峰，且保留时间、质谱数据与染料木素对照品一致，故化合物32为genistein。

化合物28一级质谱分子离子峰为m/z 461[M+H]+，二级质谱存在m/z 299[M+H-C6H10O5]+，结合文献[12]报道，推测该化合物为8-methoxyononin。

化合物分33一级质谱分子离子峰为m/z 355[M+H]+，二级质谱存在m/z 337[M+H-H2O]+，229[M+H-H2O-C6H4O2] +，结合文献[12]报道，推测该化合物为hydroxytuberosone。

化合物34一级质谱分子离子峰为m/z 269[M+H]+，二级质谱产生m/z 254[M+H-CH3]+，结合文献[13]报道，推测该化合物为formononetin。

化合物35一级质谱分子离子峰为m/z 321[M+H]+，二级质谱产生m/z 279[M+H-C3H6]+，251[M+H-C3H6-H2O]+，结合文献[13]报道，推测该化合物为corylin。

3.2 葛根水提液多成分吸收代谢研究

继续运用液质联用技术对葛根多成分在肠壁的吸收和代谢情况进行了研究，结果见表1，由表可知，葛根水提液36个成分中，17个成分可在血浆样品中检测到，表明其可以原型吸收入血；另外有19个成分未在血浆样品中检测到，表明其可能未吸收或与肠壁酶结合，发生代谢；此外在血浆样品中检测到一个代谢产物daidzin-4′-O-β-sulfate，其可能由大豆苷元或苷经肠壁酶代谢转化而来。

4 讨论

本实验通过对葛根水提液及血浆样品的检测，明确了葛根水提液多成分信息及其肠吸收情况，其中17个成分可以原型吸收入血，可初步用于中药生物药剂学分类系统肠渗透性定量评价研究；19个成分未能在血浆样品中检测到，印证了肠壁环境对中药多成分吸收产生的极大影响，故研究肠壁酶及转运蛋白对中药多成分的影响，有助于厘清中药多成分生物药剂学分类系统分类变化的机制。而对其代谢情况进行分析，只找到了1个代谢产物daidzin-4′-O-β-sulfate，同时由表1可知，葛根水提液中，除化合物33和35外，所检测到的成分多为异黄酮类成分，其化学结构相似，且已有研究表明不同异黄酮类成分之间通过体内代谢可以发生转化[16]，故推测血浆样品中未检测到的成分除不吸收或微量以致无法测定外，还极有可能经肠壁代谢转化为可吸收成分。下一步通过对不吸收成分和已吸收单体化合物的体外代谢实验研究则可进一步厘清葛根中多成分代谢关系，充分阐明多成分环境中代谢对吸收的影响，为多成分肠渗透性评价定量研究奠定基础。

另一方面，中药发挥药效是其多成分对应多靶点、多途径的综合作用结果[17]。这些成分在到达体循环前的代谢变化及产生的代谢产物决定了其产生疗效与否，因此多成分吸收代谢是中药科学研究的重点。徐风等[18]提出中药药效物质的“叠加作用”，其中指出进入体内的中药多成分及其代谢物可能因为具有相同的药效基团而作用于同一靶点产生叠加效应，这就又使多成分吸收代谢研究显得尤为重要。

[参考文献]

[1] 谭晓斌， 贾晓斌， 陈彦， 等. 从肠吸收屏障网络进行中药基础研究的思路及探索[J]. 中草药， 2009（10）： 1520.

[2] 平其能.中药成分的胃肠转运与剂型设计[M].北京：化学工业出版社，2010：146

[3] Amidon G L， Lennerns H， Shah V P， et al. A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification： the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability[J]. Pharm Res，1995， 12（3）： 413.

[4] FDA.Waiver of in vivo bioavailability and bioequivalence studies for immediate-release solid oral dosage forms based on a biopharmaceutics classification system [EB/OL].[2016-11-13].http//www.fda.gov/cder/guidance/3618fnl.

[5] Tsume Y， Mudie D M， Langguth P， et al. The biopharmaceutics classification system： subclasses for in vivo predictive dissolution （IPD） methodology and IVIVC[J]. Eur J Pharm Sci， 2014， 57： 152.

[6] ⒀螅 隗丽， 董玲， 等. 多成分体系下中药生物药剂学分类系统的构建分析[J]. 中国中药杂志， 2014， 39（23）： 4479.

[7] 杨文宁， 李博， 王豪， 等. 肠 S9 温孵法研究川芎多成分肠吸收过程中的肠壁代谢[J]. 中国中药杂志， 2016， 41（7）： 1188.

[8] 刘洋， 罗志强， 吕贝然， 等. 多成分药物序贯代谢方法用于川芎水煎液多成分不同阶段吸收代谢研究[J]. 中国中药杂志， 2016， 41（7）： 1178.

[9] Wei Shuyong， Chen Yi， Xu Xiaoyu. Progress on the pharmacological research of puerarin： a review[J]. Chin J Nat Med， 2014， 12（6）： 407.

[10] Li H， Dong L， Liu Y， et al. Biopharmaceutics classification of puerarin and comparison of perfusion approaches in rats[J]. Int J Pharm， 2014， 466（1）： 133.

[11] Jung H R， Kim S J， Ham S H， et al. Simultaneous determination of puerarin and its active metabolite in human plasma by UPLC-MS/MS： application to a pharmacokinetic study[J]. J Chromatogr B， 2014，971（15）： 64.

[12] Song W， Ye M. Chemistry of the Chinese herbal medicine Puerariae Radix （Ge-Gen）： a review [J]. J Chin Pharm Sci， 2014， 23（6）： 347

[13] 周永刚， 吴思， 毛飞， 等. 葛根中黄酮类化学成分的UHPLC-Q-TOFMS分析[J]. 药学实践杂志， 2013， 31（2）： 116.

[14] 钟敬华. 基于液质联用技术的脑得生片和胃复春片物质基础辨识方法研究[D].杭州：浙江大学，2010.

[15] 张岩. 葛根组分库的建立及雌激素活性的研究[D].大连：中国科学院研究生院大连化学物理研究所，2005.

[16] Prasain J K， Jones K， Brissie N， et al. Identification of puerarin and its metabolites in rats by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J Agric Food Chem， 2004， 52（12）： 3708.

[17] Keith C T， Borisy A A， Stockwell B R. Multicomponent therapeutics for networked systems[J]. Nat Rev Drug Discov， 2005， 4（1）： 71.

[18] 徐L，杨东辉，尚明英，等. 中药药效物质的“显效形式”、“叠加作用”和“毒性分散效应”――由中药体内代谢研究引发的思考[J]. 世界科学技术――中医药现代化，2014，16（4）：688.