关于大豆异黄酮检测方法的探讨

摘 要：大豆异黄酮主要存在于豆科蝶形花亚科植物中，是大豆生长中形成的一类次级代谢产物。本文通过查阅文献简述了大豆异黄酮检测的主要方法的原理及优势。以期对大豆异黄酮的研究有所帮助。

关键词：大豆异黄酮；检测

中图分类号：S565.1 文献标识码：A

大豆异黄酮主要存在于豆科蝶形花亚科植物中，是大豆生长中形成的一类次级代谢产物。其主要成分是：大豆甙，大豆甙元，染料木甙，染料木素，黄豆黄素，黄豆黄素甙元。由于它是从植物中提取，有着与雌激素相似的结构，因此大豆异黄酮又称植物雌激素。可防治一些和雌激素水平下降有关的疾病，如：延缓女性衰老、改善更年期症状、预防骨质疏松等疾病，同时可提高机体免疫力，抗氧化、抗溶血等。目前，大豆异黄酮的检测方法有：利用紫外吸收特征检测、色谱原理检测、医学荧光免疫法检测。

1 利用紫外吸收特征检测

1.1 紫外分光光度法

大豆异黄酮结构中的羟基和芳香环形成较强的共轭体系对波长在250～260nm的紫外光有较强的特征吸收峰，且它的各组分最大吸收波长相差不大，峰数目较少。可采用紫外分光光度法对大豆异黄酮进行含量测定。该法简便，重现性好，准确性及灵敏度较高，使用的试剂毒性小、廉价易得。黄莉等[1]以染料木素为标准品，在紫外最大吸收峰260nm处，用紫外分光光度法测定大豆豆粕中异黄酮的含量。回归方程A=0.1676X-0.0118r=0.9982，平均回收率为99.84%，相对标准偏差为1.03%。

1.2 三波长法

三波长吸光光度法根据大豆异黄酮在240nm、260nm、280nm三个波长处吸光值，分别计算A，计算方法为：A=A260一(A240+A280)／2。A与待测物浓度成正比，进而求得待测物质浓度。在提取大豆异黄酮时，多用乙醇为溶剂，色素及醇溶性蛋白等也被提取出来。若用单波长法测定，背景会产生较大吸收，降低了测定的准确度。三波长法可以有效地消除这些干扰，并且方法简便，灵敏，省时，重现性好，所用仪器便宜。鞠兴荣等[2]采用三波长紫外分光光度法测定大豆异黄酮含量，有效地消除了随浓度不同发生的本底漂移、油脂等干扰物质及吸收峰不对称给定量分析造成的影响。最低检出浓度为1μg/ml，加样回收率99％，具有良好的准确性和精密度。

2 利用色谱的原理检测

2.1 高效液相色谱法

高效液相色谱法是目前检测大豆异黄酮应用最广泛的一种方法。所用色谱柱一般以小粒径填料填充，其柱效高、分离效果好。同时，柱后可接多种高灵敏度检测器，对流出物可进行连续检测。此法具有成本低、样品制备步骤少、准确性高、仪器自动化程度高等优点。张磊等[3]采用HPLC法，Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相:甲醇20.3%磷酸溶液(体积比48∶52)，流速0.7mL/min，测定波长260nm，柱温25℃。结果制备的大豆异黄酮苷元总含量为70.98%;大豆苷元、黄豆黄素和染料木素平均回收率分别为98.7%、98.9%和99.2%，RSD分别为2.1%、1.6%和1.4%。

2.2 高效液相色谱～质谱法

高效液相色谱一质谱法在测定大豆异黄酮含量时只需3种黄酮糖苷标样就可以对其进行定量分析，解决了单纯用高效液相色谱法时标样缺乏的难题，且该法能迅速准确的确定检测大豆异黄酮液相色谱图中各色谱峰归属。是一种先进、高效、快捷的分析技术。以大豆胚芽、大豆粕等原料用60%乙醇提取，高效液相色谱法分析大豆中8种异黄酮成分，并根据色谱峰的质谱特征，鉴定出各种异黄酮。采用Novapak C18柱(Φ3.9×150mm，4μm)，流动相为A-0.1%乙酸/水、B-0.1%乙酸/乙腈，梯度洗脱，柱温40℃，检测波长为254nm，外标法定量，检测时间23min。测定4种异黄酮的相对标准偏差(RSD)为0.5%~1.2%，回收率99.01%~103.0%。

2.3 毛细管电泳法

毛细管电泳法是以高压电场为驱动力，毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上差异而实现分离技术。该法准确、可靠、经济、操作简便。目前，已逐渐成为测定植物雌激素的常规方法之一。叶静等[5]测定豆粕及发酵豆粕中大豆异黄酮含量。方法:采用胶束毛细管电泳法，未涂层弹性石英毛细管(50μm×60cm，50cm);压力进样，压力:3.0×103Pa;进样时间:5s;分离电压:17kV;柱温:20℃;检测波长:254nm;运行缓冲液:15mmol.L-1十二烷基硫酸钠、5%甲醇的10mmol.L-1硼砂溶液(pH9.4)。结果:测得6种大豆异黄酮组分在24min内能完全分离并具有良好的线性关系;平均加样回收率(n=5)在99.6%~103.5%之间，RSD为1.8%~2.3%。

2.4 薄层扫描色谱法

薄层扫描色谱法利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，当移动相流过固定相时，连续产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，来达到分离各成分的目的。此法适用于挥发性较小或较高温度易变化且不能用气相色谱分析的物质。该法有灵敏度及分辨率高、分离快速、操作方便、样品预处理简单、设备简单等优点。但其薄层显色剂用量难以准确控制，人为误差较大。徐颖等[6]采用聚酰胺薄层色谱法分离鉴定异黄酮，以乙醇-水-甲酸(4∶1∶0.1)为展开剂，染料木甙的Rf值0.70、大豆甙元的Rf值为0.51、染料木素的Rf值为0.43。

2.5 双向纸层析色谱法

双向纸层析法适用于分离鉴定复杂的混合物。方法：以滤纸做载体，利用第一种层析系统进行第一向层析后，将滤纸烘干，滤纸旋转90°，用另一层析系统进行第二向层析。该法有着重现性好、特异性高、操作简单、设备要求不高的特点。在没有高效液相色谱仪的情况下，要了解异黄酮提取工艺中每一个流程异黄酮的变化双向纸层析色谱法是较为理想的方法。彭义交等[7]采用双相纸层析方法对大豆异黄酮进行分离，其结果与液-质色谱法基本吻合。

其它还有气相色谱法和气相色谱－质谱法。气相色谱法具有准确度高、重现性好、灵敏度及特异性高等优点，但此法操作较繁琐、耗时长、设备昂贵。因此，限制了该法推广。气相色谱－质谱法，灵敏度高，定性能力更准确，可用于食品中大豆苷元和染料木素常规分析的方法。这两种方法国外学者应用的比较多。四标样快速测定法以其准确、快速、简单的特点，满足工业生产过程中检测的需要。

3 医学上荧光免疫法

主要包括时间分辨荧光免疫分析法、酶联免疫吸附法。这两种方法重现性好、特异性高、灵敏、结果判断客观准确、实用性强。目前已广泛在临床医学中用于研究血浆、尿液及粪便中大豆异黄酮体检测。

参考文献

[1]黄莉等.紫外分光光度法测定豆粕中大豆异黄酮的含量[J].科技信息，2010年26期.

[2]鞠兴荣等.三波长紫外分光光度法测定大豆异黄酮的研究[J].食品科学，2001年5期.

[3]张磊等.大豆异黄酮苷元检测方法的研究[J].广东药学院学报，2008年2月第24卷.

[4]龚凌霄等.高效液相色谱-质谱法快速测定大豆异黄酮含量[J].中国油脂，2006年2期.

[5]叶静等.胶束毛细管电泳测定豆粕及发酵豆粕中大豆异黄酮含量[J].中国药学杂，2010年3期.

[6]徐颖等.聚酰胺薄层色谱法分离鉴定异黄酮[J].中国粮油学报，2005年第5期.

[7]彭义交等.大豆异黄酮双向纸层析分析方法的研究[J].食品科学，2004年第4期.