脓毒症大鼠早期心肌损害与功能障碍的实验研究

心功能下降是严重烧伤及脓毒症患者常见致命的并发症,50%脓毒症患者出现不同程度的心肌抑制，病死率极高［1］，所以维持正常的心功能是成功救治严重烧伤及脓毒症患者的关键之一。脓毒症可引起心肌功能抑制即收缩功能损害, 以心脏扩大、射血分数下降、对容量负荷收缩反应差、收缩峰值压力/收缩末期容积比值下降为特征。本实验通过有创性心肌力学测量，及心肌细胞电镜下观察和血清肌钙蛋白I检测探讨早期脓毒症心肌细胞损害和心肌功能的变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

清洁级SD大鼠72只，雌雄各半，体质量（250±30） g，购于安徽医科大学动物中心［许可证号：scxk(皖)2005-001］。72只SD大鼠染色编号，随机（随机数字法）分成3组:正常对照组(A组，n=8);假手术组（B组，n=32）和脓毒症组(C组，n=32)。假手术组和脓毒症组又分为手术后3、6、12、24 h时相点4个亚组（B1，B2，B3，B4，C1，C2，C3，C4），每时相点亚组8只。动物分笼饲养。

1.2 动物模型制备

试验性饲养一周，术前各组大鼠禁食过夜（自由饮水）。依照相关文献［2］方法行盲肠结扎穿孔术(CLP)复制脓毒症动物模型。以10%水合氯醛(0.03 ml/kg)皮下注射麻醉后固定、铺无菌洞巾。沿腹正中线作约1.5 cm切口，找到盲肠，在盲肠根部结扎盲肠，避免结扎回肠及盲肠系膜血管。用 18 号针穿刺盲肠3次，防止针孔闭合，挤压盲肠致有粪便溢出。之后，将盲肠还纳腹腔，逐层缝合腹壁切口。术毕，立即在大鼠皮下注射生理盐水5 ml抗休克。假手术组打开腹腔找到盲肠后缝合腹壁切口，盲肠不作穿刺。

1.3 心肌力学测量

正常对照组在3 h时点，假手术和脓毒症组在3、6、12、24 h 4个时点分批用水合氯醛麻醉大鼠, 经左颈内动脉插入聚乙烯导管至左心室腔内,利用BIOPAC的11A2055型生物机能实验系统, 分别于3、6、12、24 h 4个时点行左室收缩峰压(LVSP)、左室压力最大上升速率 (+dp/dtmax)、左室压力最大下降速率(-dp/dtmax)指标测定。测定之后打开大鼠腹腔，在腹主动脉抽取血标本进行肌钙蛋白I检测。大鼠因失血性休克死亡，立即取出心脏，切取部分心肌置于2.5%戊二醛液中固定。

1.4 心肌细胞电镜下观察

心肌组织经过固定、包埋、瑞士产LKB-Ⅳ型超薄切片机切片后，置于日产JEM-1230型透射电镜下观察。

1.5 血清肌钙蛋白I检测

抽血置于试管后，在4 ℃下，4000 r/min离心10 min（80-2型离心机，上海手术器械厂），分离血清并置于-80 ℃冰箱中保存。应用酶联免疫原理检测血标本中心肌肌钙蛋白I（cTnI）的含量，检测试剂盒购于南京基蛋生物技术有限公司，严格按说明书进行操作。

1.5 统计学方法

计量资料以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS 13.0统计软件分析数据，组间比较采用SNK-q检验。以P

2 结果

2.1 心肌力学、血清cTnI的动态变化

脓毒症组在CLP后3 h即出现LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax指标下降, 在6 h时点达最低，12 h开始回升，但仍低于正常和假手术组（P＜0.05）；脓毒症组在CLP后3 h血清cTnI水平即升高, 与正常对照组和假手术组相比差异有统计学意义(P

2. 2 心肌细胞电镜下超微结构变化

随脓毒症的发生发展，心肌肌原纤维间距离增宽，肌原纤维溶解破坏加重，心肌细胞肌浆网扩张明显，线粒体肿胀、结构不清，但线粒体数量有增多表现。如图1所示。

3 讨论

本研究采用大鼠盲肠结扎加穿孔法复制脓毒症模型，通过盲肠的结扎和穿孔, 使有菌的肠内容物污染腹腔造成弥漫性腹膜炎,诱发广泛的全身性炎性反应，大鼠表现出与临床相似的早期高动力循环、高代谢和晚期低动力循环状态,是目前公认的临床相关性较强的脓毒症模型。心肌功能不全是脓毒症常见的并发症,对脓毒症、MODS的预后有着重要影响。

目前cTnI是公认的反映心肌损伤程度高敏感高特异的金标准， cTnI升高与各种心肌损害因素导致心肌细胞膜渗透性升高和肌钙蛋白降解与泄露有关［3］。本实验结果显示在脓毒症状态下cTnI显著增高,在12 h达到高峰，以后有所下降，但仍然显著高于正常值，与王晓鹏等［4］报道相似。肌钙蛋白I升高说明脓毒症状态下存在明显的持续性心肌损伤,心肌细胞结构改变破坏, 心肌细胞膜通透性增加，肌钙蛋白裂解溢出 , 从而导致血液肌钙蛋白水平升高。肌钙蛋白I升高后下降的原因可能与心肌细胞胞质内肌钙蛋白的释放与降解的动态平衡及肌钙蛋白的耗竭有关［4］。脓毒症状态下随时间迁移，在透射电镜下亦观察到心肌肌原纤维间距离增宽，肌原纤维溶解破坏逐渐增多、加重，细胞器出现肌浆网扩张，线粒体肿胀、结构模糊等损害表现，且随时间推移逐渐加重，但在24 h时点观察到线粒体数量有增多表现。

LVSP、+dp/dtmax是反映心肌收缩功能的敏感指标, -dp/dtmax则是反映心肌舒张功能的敏感指标。目前多认为脓毒症中过度释放的多种炎性细胞因子（如TNF,IL-1等）,肾上腺素-环腺苷酸信号传导障碍，心肌细胞内游离钙稳态调控失衡，心肌缺血和代谢产物，心肌细胞大量凋亡等，是引起心肌舒缩功能障碍的主要原因［5-6］。本实验结果显示CLP后3 h即出现LVSP、±dp/dtmax显著下降, 在6 h时达到最低值（71.0±6.5) mm Hg,在12 h 后有回升表现，但仍低于正常对照组，提示脓毒症早期即有心肌收缩舒张功能障碍，且随时间推移有短暂恢复趋向。脓毒症状态下心肌损害为进行性加重，而心肌收缩舒张功能并非逐渐下降的具体机制尚不清楚，笔者认为可能的原因有：（1）部分心肌抑制性物质，如炎性细胞因子的半衰期较短，脓毒症早期大量释放后代谢消耗，短期内可能减轻对心肌抑制作用；（2）脓毒症时血管通透性增加，循环血量相对不足，机体为代偿，通过神经内分泌等负反馈调节增加心肌收缩舒张功能，短暂提高心脏泵血能力；（3）脓毒症时缺血缺氧诱导心肌细胞线粒体增生，进而为心肌舒缩活动提供能量。

本实验证实脓毒症早期即有心肌功能下降, 血清肌钙蛋白I升高，说明脓毒症早期心肌损害就比较明显，提示在临床中脓毒症早期即应该注意心脏功能保护与支持。然而，实验中发现心肌收缩舒张功能的变化与心肌损害程度不相一致的机理尚有待进一步深入研究。

参考文献

［1］Flierl MA,Rittirsch D,Huber-Lang MS,et a1.Molecular events in the cardiomyopathy of sepsis［J］.Mol Med,2008,14(5/6):327-336.

［2］汤耀卿,李磊.脓毒症动物模型制作方略及应用［J］.中华实验外科杂志,2006,23（12）:1433-1434.

［3］Favory R,Neviere R.Significance and interpretation of elevated troponin in septic patients［J］.Critical Care,2006,10(4):224.

［4］王晓鹏, 牟晓杰, 陈丽.脓毒症大鼠血清cTnI、TNF-α和心肌NF-кB的变化［J］.临床医药实践杂志,2007,16(12B):1206-1208.

［5］姚永明，盛志勇.脓毒症防治学［M］.北京，科学技术文献出版社，2008，385-394.

［6］Tateishi Y,Oda S,Nakamura M,et a1. Depressed heart rate vari-abilityis associated with high IL-6 blood level and decline in blood pressurein septic patients［J］.Shock,2007,28(5):549-553.

（收稿日期：2012-03-03）