茎瘤芥黑斑病菌rDNA ITS区序列分析

摘要：以茎瘤芥（Brassica juncea Coss. var. tumida Tsen et Lee）黑斑病病株为试材，对黑斑病菌5.8 S rdna及其侧翼its区序列进行克隆、测序和比对分析。结果表明，5个供试病菌碱基序列同芸薹链格孢的碱基序列相似度达到99.68%，不存在大于3 bp的碱基差异；而与甘蓝链格孢和萝卜链格孢的碱基差异较明显，均存在大于3 bp的碱基差异，且存在大量的缺失片段。初步确定引起茎瘤芥黑斑病的病原菌为芸薹链格孢。

关键词：茎瘤芥（Brassica juncea Coss. var. tumida Tsen et Lee）；黑斑病；ITS；芸薹链格孢

中图分类号：S436.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）20-5044-03

Sequence Analysis of ITS Region of rDNA of Brassica juncea Coss. var. tumida Tsen et Lee Black Spot Disease

LIU Hong-fang，CHEN Fa-bo，YANG Yong-qiang

（Life Science and Technology Institute， Yangtze Normal University， Chongqing 408100，China）

Abstract：Taking Brassica juncea Coss. var. tumida Tsen et Lee black spot disease as materials， 5.8 S rDNA and its flanking ITS were cloned， sequenced and aligned. The results showed that the sequence of 5 pathogen were almost identical with that of Alternaria brassicae. Similarity degree reached 99.68%. There was no differences more than 3 bp base. There were obvious differences between the sequence of A. brassicicola and A. japonica， more than 3 bp different base and a lot of deletions. It was prelimiarily dertermined that the pathogen caused the black spot disease on Brassica juncea Coss. var. tumida Tsen et Lee was Alternaria brassicae.

Key words： Brassica juncea Coss. var. tumida Tsen et Lee； black spot disease； ITS； Alternaria brassicae

茎瘤芥（Brassica juncea Coss. var. tumida Tsen et Lee）是我国特有的作物资源，榨菜是利用其瘤茎为原料，经过专门的加工腌制而成的一种腌菜食品。在我国以“涪陵榨菜”最为著名，与欧洲酸菜、日本酱菜并称世界三大名腌菜[1]。榨菜是重庆三峡库区重要的农业支柱产业之一，是当地农业生产的主要经济来源。黑斑病是茎瘤芥的主要病害之一，发生普遍，主要发生在茎瘤芥的茎和叶片上，此病发生后蔓延迅速，可导致茎瘤芥叶片枯死，植株早衰，甚至腐烂，严重影响茎瘤芥的产量和品质。

研究表明，引起十字花科蔬菜黑斑病的病原菌包括芸薹链格孢（Alternaria brassicae）、甘蓝链格孢（A. brassicicola）和萝卜链格孢（A. japonica）[2]。链格孢属内不同种之间培养性状不稳定，且高度相似和重叠，在实际操作中用传统方法很难鉴定到种的水平[3]。Jasalavich等[4]对十字花科蔬菜上的链格孢属真菌核糖体DNA序列进行分析比较，认为可以基于其进行分类鉴定。目前，关于茎瘤芥黑斑病的研究鲜见报道。本试验以我国茎瘤芥主产区涪陵5个不同种植区的茎瘤芥黑斑病病株为试材，通过对茎瘤芥黑斑病菌rDNA ITS序列进行分析，探索基于该区进行茎瘤芥黑斑病菌种水平上分类鉴定的可靠性，以期为该病的进一步研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试材料于2011年12月采自重庆市涪陵区李渡镇、义和镇、焦石镇、马武镇、石胜镇等5个茎瘤芥种植区。选取新发病的叶片作为分离材料，分离到的菌株经单孢纯化后保存于PDA培养基斜面上，分别编号为L1（李渡镇）、L2（义和镇）、L3（焦石镇）、L4（马武镇）、L5（石胜镇）等，置于4 ℃冰箱中贮存备用。

1.2 基因组DNA的提取

将供试菌株在 PDA培养基上培养7～10 d，用无菌水洗下菌落表面的菌丝和分生孢子，转接到SN液体培养基中，在25 ℃、150 r/min的条件下培养4～5 d后真空抽滤收集菌丝体，-20 ℃保存备用。采用CTAB法提取基因组DNA[5]。

1.3 ITS序列的PCR扩增

利用上海英骏公司合成的引物（上引物5′TCC

GTAGGTGAACCTGCGG3′，下引物5′TCCTCCGCTT

ATTGATATGC3′）进行扩增。PCR扩增反应体系（25 μL）：无菌水6.5 μL，2×Taq MasterMix 12.5 μL，上、下引物（10 ng/mL）各2 μL，DNA 2 μL（含100 ng DNA），液体石蜡 20 μL。2×Taq MasterMix由上海生工生物工程有限公司提供。反应程序为：95 ℃ 预变性 5 min，1个循环；95 ℃变性 40 s，56 ℃ 退火40 s，72 ℃延伸 1 min，35 个循环；72℃ 延伸 10 min，1个循环；最后4 ℃保存。

1.4 PCR扩增产物的克隆及测序

利用SanPrep柱式DNA凝胶回收试剂盒（上海生工生物工程有限公司），对PCR扩增后的目的片段进行回收、纯化。利用pMDl9-T载体（大连宝生物工程有限公司）对纯化后的产物进行连接。连接体系（10 μL）：回收纯化的DNA 4 μL，载体1 μL，Solution I 5 μL，在16 ℃下连接过夜。利用Competent Cell Preparation Kit 试剂盒（大连宝生物工程有限公司）制备DH5α感受态细胞，将连接液加入感受态细胞中，42 ℃热击转化，用无氨苄青霉素（Amp）液体LB培养基37 ℃、150 r/min培养1 h，使菌体复苏。用涂布棒将菌液均匀地涂在含有Amp的LB固体培养基上，置于37 ℃恒温培养箱中，过夜培养12～16 h。挑取阳性克隆的大肠杆菌加入到Amp 液体LB培养基中，37 ℃、150 r/min条件下培养至菌液浑浊（约2 h）。采用PCR法对阳性克隆进行鉴定，PCR反应体系（15 μL）：7.5 μL 2×Taq MasterMix，上、下引物（10 ng/mL）各1 μL，菌液1 μL（含50 ng DNA），无菌水 4.5 μL。PCR反应程序与1.3相同，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。每份材料挑取5～20个单菌落。将获得的菌液送至上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.5 序列分析

测序结果出来后，用CExpress软件进行序列拼接，在美国国立生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）进行Blast序列比对，并搜索已发表的芸薹链格孢、甘蓝链格孢及萝卜链格孢的核糖体5.8 S rDNA及其侧翼的ITS区序列，利用DNAMAN 4.0软件进行序列比对，确定感染茎瘤芥黑斑病病原菌的种类。

2 结果与分析

采用DNAMAN 4.0软件比对5个茎瘤芥黑斑病核糖体5.8 S rDNA及其侧翼的ITS区序列，发现5个DNA的序列基本相同，不存在大于3 bp的碱基差异，推测感染这5份材料的黑斑病病菌可能是同一种。再将5个茎瘤芥基因序列与已公布的芸薹链格孢、甘蓝链格孢和萝卜链格孢对应序列进行比对分析。

将茎瘤芥黑斑病rDNA ITS区序列与芸薹链格孢相应区域序列进行对比，芸薹链格孢GeneBank登录号为FJ869872，片段长度为575 bp，序列对比有差异的碱基如图1所示。由图1可知，5个序列与已公布的芸薹链格孢相应序列的相似度达到99.68%，且不存在大于3 bp的碱基差异。5个茎瘤芥rDNA ITS区域序列与芸薹链格孢对应序列存在的差异仅为2个碱基，这可能与测序误差有关。

茎瘤芥黑斑病rDNA ITS区序列与甘蓝链格孢相应区域序列进行比对，甘蓝链格孢GeneBank登录号为JF417686，片段长度为514 bp，其序列比对中出现较大差异部分如图2所示。由图2可知，6组序列在65～67 bp和70～72 bp处分别存在3个碱基的插入/缺失，且在48～62 bp处碱基存在大量插入/缺失。

茎瘤芥黑斑病rDNA ITS区序列与萝卜链格孢相应区域序列进行对比，萝卜链格孢GeneBank登录号为JF742643，片段长度为553 bp，比对有差异的序列见图3。由图3可知，6组序列在61～64 bp处存在4个碱基差异，在175～177 bp处存在3个碱基差异，在536～541 bp处存在6个碱基差异，且在65～95 bp处存在大量的插入/缺失，542～544 bp处存在3个碱基的插入/缺失。

综上分析，5个供试序列与已公布的芸薹链格孢序列的相似度达到99.68%，且不存在大于3 bp的碱基差异；与甘蓝链格孢和萝卜链格孢序列的相似度分别为95.62%和92.86%，且存在3 bp及以上的碱基差异。因此，可以确定感染采集茎瘤芥植株的黑斑病病菌种类为芸薹链格孢。

3 结论与讨论

芸薹链格孢Alternaria brassicae，甘蓝链格孢A. brassicicola和萝卜链格孢A. japonica均可引起十字花科蔬菜黑斑病。经过对供试Alternaria属真菌核糖体5.8 S rDNA及其侧翼ITS区的测序结果表明，5个序列与已公布的芸薹链格孢相似度达到99.68%，且不存在大于3 bp的碱基差异；与甘蓝链格孢和萝卜链格孢的相似度分别为95.62%和92.86%，且存在3 bp及以上的碱基差异。初步确定，引起茎瘤芥黑斑病的病原菌为芸薹链格孢Alternaria brassicae。

本试验证明rDNA-ITS序列分析法在茎瘤芥黑斑病菌的分类鉴定上的可行性，但从测序结果来看，试验所用特异性引物还可以改良，根据测试的序列比对分析，将本次试验的下引物改为如下序列将更适宜，改良后的下引物为：5′TCCTCCGCTTATT

GATATGC3′，特异性引物改良后使扩增条带更明显、更清晰；另外，供试材料为5份，有些偏少，且采集地点集中于涪陵地区，代表性不强，不能确定引起茎瘤芥黑斑病菌的只有芸薹链格孢。因此，甘蓝链格孢A. brassicicola和萝卜链格孢A. japonica是否也可引起茎瘤芥黑斑病还需进一步研究。

参考文献：

[1] 肖崇刚，郭向华，韩海波，等.涪陵榨菜根肿病病菌鉴定及主要特性[J].西南农业大学学报，2002，24（6）：539-541.

[2] 李明远.十字花科蔬菜黑斑病识别与防治[J].当代蔬菜，2004（10）：34-35.

[3] 肖长坤，李 勇，李健强.十字花科蔬菜种传黑斑病研究进展[J].中国农业大学学报，2003，8（5）：61-68.

[4] JASALAVICH G A， MORALES V M， PELCHER L E， et al. Comparison of nuclear ribosomal DNA sequence from Alternaria species pathogenic to crucifers[J]. Mycological Research，1995， 99（5）：604-614.

[5] GRAHAM G C， MAYERS P， HENRY R J. A simplified method for the preparation of fungal genomic DNA for PCR and RAPD analysis[J]. Biotechniques，1994，16（1）：48-50.