基于trnH—PsbA序列的部分苔藓植物亲缘关系分析

摘要：以毛地钱（Dumortiera hirsuta）为外类群，利用ClustalX 2.0和MEGA 4.1软件对13种苔藓植物的trnH-PsbA基因序列进行比对和分析，构建分子系统树。结果表明，13种苔藓植物的trnH-PsbA序列长度为174～186 bp，排序后总长度为191 bp，其中变异位点51个，信息位点30个。遗传距离在0.006～0.200，平均遗传距离为0.103。利用非加权组平均数UPGMA（Unweight pair group method with arithmetic mean）法建立的系统树显示，13种苔藓植物分为3组。在科间水平上，序列分析结果与形态学结果一致，trnH-PsbA序列对于苔藓植物的系统发育研究有一定的参考价值。

关键词：苔藓；DNA条形码；trnH-PsbA；亲缘关系；系统发育分析

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）20-5057-03

The Phylogenetic Relationship of Some Bryophytes Based on trnH-PsbA Gene

LIU Ying1，ZHANG An-shi1，ZHAO Li-xin2

（1. Department of Biology， Jiaozuo Teachers College， Jiaozuo 454003， Henan， China；

2. Jiaozuo National Foresty Plant of Henan Province， Jiaozuo 454191，Henan， China）

Abstract： Using Dumortiera hirsuta as the outgroup， trnH-PsbA genes belonging to 13 bryophyte species were analyzed and aligned to construct the phylogenetic trees using ClustalX 2.0 and MEGA 4.1 softwares. The results showed that the length of trnH-PsbA gene in 13 bryophytes were between 174 bp and 186 bp. The total length of sequence was 191 bp after alignment， including 51 variable sites and 30 informative sites. The genetic distance were between 0.006 and 0.200， with the average of 0.103. 13 species in the UPGMA tree（Unweight pair group method with arithmetic mean tree） were clustered into three groups. The constructed phylogenetic trees based on sequences were consistent with the results based on morphology among families. It is proved that trnH-PsbA sequence is useful for studying phylogenetics of bryophytes.

Key words： bryophyte； DNA barcoding； trnH-PsbA； phylogenetic relationship； phylogenetic development analysis

2003年，加拿大学者Hebert等[1]利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（Cytochrome C oxidase subunit Ⅰ，COI） 中的一段650 bp序列，发现该基因序列在动物界不同分类水平上都具有良好的识别能力，从而提出了DNA条形码（DNA barcoding）的概念，建立了一种新的物种鉴定技术[2]，为解决传统分类学面临的难题提供了新方法。由于线粒体COI基因在植物中的进化速率远慢于动物，因此，很多学者认为植物的条形码应从进化速率较快的叶绿体基因组中选择[3，4]。

trnH-PsbA序列是进化速率最快的叶绿体间隔区之一，两端存在75 bp的保守序列，便于引物的设计。作为植物DNA条形码的候选片段，trnH-PsbA序列具有引物通用性较好、扩增成功率较高[5-8]等特点，并且平均长度较短，有利于对降解材料的扩增。本研究对13种苔藓植物的trnH-PsbA序列进行测序并分析，从DNA水平上探讨它们的亲缘关系，为苔藓植物系统发育研究、苔藓植物的数字化鉴定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验材料除毛地钱（Dumortiera hirsuta）（作为外类群，GenBank序列号：HQ026394.1）外，均采自河南省云台山世界地质公园（表1）。

1.2 PCR扩增及序列测定

采用改良CTAB法[9]提取苔藓植物的基因组DNA。PCR引物为：PsbA-1f，5′- CTTGGCTCTTGCA

ACGATGA-3′； trnH-1r，5′-CCTCCCGCTTATTGATA

TGC-3′。PCR反应体积为35 μL，包括3 ng/μL DNA 2.8 μL、10 μmol/L上、下游引物各2.1 μL、2×Taq Master Mix 17.5 μL；RNase-Free Water 10.5 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并送至金唯智生物科技（北京）有限公司纯化后进行单向测序。

1.3 序列分析和系统树构建

以毛地钱为外类群，将获得的DNA序列用ClustalX 2.0软件进行比对。用MEGA 4.1软件进行数据分析和系统发育树的构建。采用MP法和UPGMA法构建分子系统树，以1 000次自举分析（bootstrap）检测各分支的置信度。

2 结果与分析

2.1 trnH-PsbA序列分析

测序结果显示，13种苔藓植物的trnH-PsbA序列长度在174～186 bp，其中鳞叶藓最长，为186 bp，狭叶拟合睫藓最短，为174 bp，其余均在176～181 bp。包括外类群毛地钱在内的14种苔藓植物的trnH-PsbA序列利用ClustalX 2.0对位排序时，将gap（空位）作missing（缺失）处理，排序后总长度为190 bp，其中变异位点118个，信息位点37个。去掉外类群，排序后总长度为191 bp，其中变异位点51个，信息位点30个。

2.2 系统发育分析

用Kimura-2-Parameter距离模式计算的遗传距离表明，13种苔藓植物的遗传距离在0.006～0.200，平均遗传距离为0.103。其中多枝青藓与小石藓最大，为0.200，弯叶青藓与绒叶青藓最小，为0.006。最大简约树的一致性指数CI为0.899 083，存留指数RI为0.838 235，存留一致性指数RCI为0.753 643。

利用UPGMA法构建分子系统树表明（图1），除外类群外，13种苔藓植物形成两个稳定的分支。第一分支包含了7种丛藓科苔藓植物，其自展支持率为82%，第二分支包含了青藓科和灰藓科等6种苔藓植物，其自展支持率为91%。其中青藓科的绒叶青藓、弯叶青藓和多枝青藓聚在一起，其自展支持率为98%；灰藓科的金灰藓、灰藓凹叶变种和鳞叶藓聚在一起，其自展支持率为62%，其分析结果与形态学结果一致。通过MP法构建的系统树（图2）与UPGMA法构建的系统树略有差异，MP树显示，灰藓科的3种苔藓植物没能完全聚类在一起，但两大分支结构基本相同，因此，trnH-PsbA序列可用于苔藓植物亲缘关系的分析。

3 小结与讨论

自从生物条形码联盟（CBOL）提出将trnH-PsbA序列作为植物DNA条形码候选片段之后，trnH-PsbA已被广泛地应用于植物的系统发育研究中[10-13]。本研究利用trnH-PsbA序列对13种苔藓植物的扩增和测序的成功率均为100%，与有关研究有相似结果[14]。trnH-PsbA序列可以很好地支持13种苔藓植物在科间水平上的亲缘关系划分。青藓科和灰藓科分别聚为一类，组成一支，丛藓科组成另一支，完全符合形态学结果。但在丛藓科苔藓植物的科内划分上与形态学结果有一定差异，如亲缘关系较近的小石藓和狭叶拟合睫藓，以及高山大丛藓云南变种和阔叶丛本藓并未聚在一起。不同的建树方法可能得到不同的效果，Lahaye等[15]通过研究发现，MP树和UPGMA树得到的物种正确识别率最高。本研究发现通过UPGMA法构建的系统树更能说明形态学结果。

由于不同序列的进化速率不同，可能导致不同序列间的分析结果有所不同，因此，随着植物DNA条形码研究的深入，科学家提出以多片段组合在不同分类阶元上并进行综合分析。Kress等[16]提出使用rbcL+matK+trnH-PsbA的片段组合构建超级矩阵来解决不同分类阶元的系统发育关系。其中trnH-PsbA（即trnH-PsbA Ⅰ，trnH-PsbA Ⅱ，trnH-PsbA Ⅲ等）片段以目为单位进行归类。本研究结果显示，13种苔藓植物的trnH-PsbA序列分析结果在科间水平上与形态学结果一致，对于苔藓植物的系统发育研究有一定的参考价值。

参考文献：

[1] HEBERT P D N，CYWINSKA A，BALL S L，et al. Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proceedings of the Royal Society of London Series B：Biological Seiences，2003，270（1512）：313-321.

[2] KRESS W J， WURDACK K J， ZIMMER E A， et al. Use of DNA barcodes to identify flowering plants[J].Proceedings of the National Academy of Sciences， 2005，102（23）： 8369-8374.

[3] CHASE M W ， SALAMIN N， WILKINSON M， et al. Land plants and DNA barcodes：Short-term and long-term goals[J].phylosophical Transactions of the Royal Society B：Biological Sciences，2005，360（1462）：1889-l895.

[4] COWAN R S， CHASE M W， KRESS W J， et al. 300，000 species to identify：problems，progress，and prospects in DNA barcoding of land plants[J].Taxon，2006，55（3）：611-616.

[5] SHAW J， LICKEY E B， BECK J T， et al. The tortoise and the hare II： Relative utility of 21 noncoding chloroplast DNA sequences for phylogeneticanalysis[J]. American Journal of Botany， 2005，92（1），142-166.

[6] KRESS W J， EFICKSON D L. A two-locus global DNA barcode for land plants：the coding rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region[J]. PloS One，2007，2（6）：e508.

[7] FAZEKAS A J， BURGESS K S. Kesanakurti P R，et al. Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well[J]. PloS One，2008，3（7）：e2802.

[8] NEWMASTER S G， FAZEKAS A J， STEEVES R A D， et al. Testing candidate plant barcode regions in the Myfisticaceae[J]. Molecular Ecology Resources，2008，8（3）：480-490.

[9] 张安世，邢智峰，刘永英，等.苔藓植物DNA不同提取方法的比较分析[J].河南科学，2009，27（5）：559-562.

[10] 杨振艳，张 玲.姜科砂仁属植物DNA条形码序列的筛选[J]. 云南植物研究，2010，32（5）：393-400.

[11] 王以红，陶晓瑜，刘海龙，等. 两个叶绿体基因位点的DNA条形码在桉属种间鉴定中的应用[J]. 园艺学报，2009，36（11）：1651-1658.

[12] 黄 海，李劲松，符岸军，等.石斛属植物DNA条形码序列的筛选[J].热带作物学报，2010，31（10）：1699-1777.

[13] 钱 丹，陈 敏，袁庆军，等.中药黄芪原植物的分子遗传学研究及其分类地位讨论[J]. 药学学报，2009，44（12）：1429-1433.

[14] 赵月梅，张 玲.蒟蒻薯属（薯蓣科）植物DNA条形码研究[J].植物分类与资源学报，2011，33（6）：674-682.

[15] LAHAYE R， BANK M V D，BOGARIN D，et al.DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2008，105（8）：2923-2928.

[16] KRESS W J， ERICKSON D L， JONES F A， et al. Plant DNA barcodes and acommunity phylogeny of a tropical forest dynamics plot in Panama[J]. Proceedings of the National Academy of Science，2009，106（44）：18621-18626.