采用组织芯片研究非小细胞肺癌中肿瘤转移相关基因1、血管内皮生长因子C的表达及意义

[摘要] 目的 采用组织芯片技术研究非小细胞肺癌中肿瘤转移相关基因1、血管内皮生长因子C的表达，分析其临床意义及其相关性。 方法 制作186例非小细胞肺癌组织及23例正常肺组织芯片，用免疫组化S-P法检测组织芯片中肿瘤转移相关基因1、血管内皮生长因子C的表达。 结果 在非小细胞肺癌中，肿瘤转移相关基因1、血管内皮生长因子C的表达阳性率分别为62.8%（103/186）和64%（119/186），与正常肺组织中的0（0/23）和17.4%（4/23）相比，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；肿瘤转移相关基因1、血管内皮生长因子C蛋白的阳性表达与非小细胞肺癌患者的TNM分期及淋巴结转移状况有关（P < 0.05），而与患者的性别、年龄和组织学类型无关（P > 0.05）。肿瘤转移相关基因1阳性表达与血管内皮生长因子C阳性表达有关（P < 0.01）。 结论 肿瘤转移相关基因1、血管内皮生长因子C在非小细胞癌的发生发展过程中起着关键作用，联合检测肿瘤转移相关基因1和血管内皮生长因子C可作为判定非小细胞肺癌侵袭性和转移性的重要方法。

[关键词] 非小细胞肺癌；肿瘤转移相关基因1；血管内皮生长因子C；转移

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）01（a）-0015-03

肺癌发病率和死亡率均居恶性肿瘤首位，严重威胁人类健康[1]。肿瘤的侵袭和转移是肿瘤的重要生物学行为特征，也是患者死亡的最主要原因。淋巴结转移是非小细胞肺癌重要的转移途径，血管内皮生因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）是特异性的新生淋巴管刺激因子，能够促进毛细淋巴管的新生并增加淋巴管内皮的通透性，从而导致肿瘤转移更易发生[2]。肿瘤转移相关基因（metastasis-associated gene 1，MTA1）是MTA（metastasisassociated）家族成员之一，被认为是核小体重构及组蛋白脱乙酰基酶复合物的组成部分，其表达的增高与多种上皮性恶性肿瘤的侵袭转移密切相关[3]。本实验对MTA1和VEGF-C的表达进行检测，结合临床、病理资料，分析它们与临床因素之间的相关性，探讨它们与非小细胞肺癌侵袭和转移之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集第八一医院全军肿瘤中心2008年1月～2010年3月的186例肺癌切除手术标本。男137例，女49例，年龄31～75岁，中位年龄55岁。肺鳞癌105例，其中低分化42例，中分化37例，高分化26例。肺腺癌81例，其中低分化35例，中分化32例，高分化14例。TNM分期：Ⅰ期40例，Ⅱ期72例，Ⅲ期61例，Ⅳ期13例。同时收集23例距肿瘤边缘>5 cm处的正常肺组织为对照。

1.2 试剂

羊抗人MTA1多克隆抗体和VEGF-C多克隆抗体均购自Santa Cruz公司，即用型免疫组化超敏S-P试剂盒、DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物试剂开发公司。柠檬酸抗原修复缓冲液、PBS缓冲液、苏木素染色剂、中性树胶封片剂、多聚赖氨酸、石蜡、各种浓度乙醇、甲醛等，均来自第八一医院病全军肿瘤中心的病理科。

1.3 方法

1.3.1 组织芯片制作 从病理科的存档中选取各型非小细胞肺癌蜡块，同时调阅相应的HE染色组织切片及患者的病历资料，同时新近收集肺癌及正常肺组织制备组织蜡块。将所有非小细胞肺癌组织蜡块分类登记，按文献要求进行设计[4]。对每一组织标本，均先观察苏木精-伊红切片以确定肿瘤部位，每一例肺癌蜡块选取4点、正常组织蜡块选取2点，共制成20×12阵列块。

1.3.2 免疫组化方法 采用S-P方法，柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复。在染色中，各种抗体染2张TMA的连续切片。另外还选择了10例相应非小细胞肺癌组织标本，作常规HE切片染色来验证组织代表性。阴性对照以PBS代替一抗。阳性对照以相应抗体的已知阳性切片作对照。结果判定：以非小细胞肺癌胞核或胞浆内出现黄色至棕褐色颗粒，定位较明确、染色明显的切片视为表达阳性。表达强度的分析，笔者采用每个切片选取5个视野，Image-Pro Plus（Media Cybe Netics Inc，USA）图像分析系统进行分析，测算单位面积平均光密度（OD）值。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 12.0处理。计数资料采用百分率表示，组间对比采用χ2检验。相关性分析采用Pearson相关分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTA1蛋白的表达

MTA1蛋白表达定位于非小细胞肺癌的细胞核，呈明显的棕黄色颗粒状。23例正常肺组织中均无阳性表达。在186例非小细胞肺癌中，共有阳性染色103例（阳性率为62.8%）；其中有淋巴结转移的117例非小细胞肺癌中，MTA1表达阳性的共有83例 （阳性率为70.9%），无淋巴结转移的69例非小细胞肺癌中，MTA1表达阳性的共20例（阳性率为29.0%）。MTA1蛋白的表达与肿瘤病理学各参数间的关系见表l。MTA1蛋白阳性表达在年龄、性别、病理组织类型方面无差异，但是在非小细胞肺癌的TNM分期、分化程度以及淋巴转移情况等方面差异有统计学意义（P

2.2 VEGF-C的表达

VEGF-C蛋白阳性染色为棕黄色颗粒，主要定位于细胞浆。在186例中有119例染色阳性（64.0%），23例正常肺组织中4例阳性表达（17.4%），两者比较差异有高度统计学意义（P < 0.01）。有淋巴结转移的117例非小细胞肺癌中，VEGF-C阳性者共98例（阳性率为83.8%），无淋巴结转移的69例非小细胞肺癌中，VEGF-C阳性表达共21例（阳性率为30.4%）。VEGF-C蛋白的阳性表达与肿瘤病理学各种参数间的关系参见表l。VEGF-C蛋白的阳性表达在年龄、性别、病理类型、分化程度方面差异无统计学意义（P > 0.05），但是在非小细胞肺癌TNM分期、淋巴结转移情况等方面差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2、表1。

2.3 MTA1蛋白和VEGF-C蛋白阳性表达的相关性

对MTA1、VEGF-C蛋白表达OD值进行了Pearson相关分析，结果表明两者有相关性（r = 0.175，P < 0.01）。

3 讨论

肺癌的五年生存率仅为16%[5]，而非小细胞肺癌（NSCLC）占全部肺癌的80%。影响生存的主要原因是肺癌的浸润和转移。肺癌淋巴结转移状态是一个重要的预后因素，由于肺内淋巴系统发达，极易发生淋巴结转移。因此，阐明肺癌淋巴结转移的分子机制有着重要的临床意义。

VEGF-C是被公认的促淋巴管生成因子，主要通过其受体VEGFR-2和VEGFR-3发挥作用，可促进肿瘤微淋巴管生成及肿瘤细胞向区域淋巴结的转移，并且能够通过淋巴系统向全身各处进行广泛的转移与扩散[6]。Weryska等[7]研究表明，肿瘤细胞能够促进淋巴管生成的调控因子VEGF-C的表达，从而诱导淋巴管新生，被诱导生成的淋巴管进一步促进了肿瘤淋巴结的转移状况。VEGF-C还可以促进淋巴内皮细胞在肿瘤细胞密集区内的大量生成，同时可以导致淋巴管明显扩张，由于新生微淋巴管的结构尚没有发育完善，依然是高渗漏的状态，从而利于肿瘤细胞渗漏入淋巴管，导致转移的发生[8]。

笔者研究显示，非小细胞肺癌组织中VEGF-C的阳性表达率为64.0%，正常组织为17.4%。两者比较差异有统计学意义（P < 0.01），提示VEGF-C在NSCLC的发生中起重要作用。VEGF-C在性别、年龄、病理组织类型、分化程度方面无差异；VEGF-C蛋白的阳性表达与非小细胞肺癌的TNM分期、淋巴结转移均有显著相关性（P < 0.01），说明VEGF-C蛋白在肿瘤的浸润转移中起着显著的作用。

肿瘤转移相关基因1（MTA1）是一个在肿瘤转移过程中表达上调的基因，1993年第一次应用差异杂交的技术，从鼠乳腺癌细胞株13762NF中分离出一种新的乳腺癌转移相关基因[9]。随后，Toh等[10]应用Southern技术，找到了其相应的同源基因，该基因的表达与乳腺癌转移能力呈正相关，故被命名为MTA1。现已证实MTA1与各种肿瘤的转移密切相关，并且在信号转导通路中起到相应的作用。Yu等[11]检测INSCLC中MTA1蛋白表达水平，结果提示，该基因的表达与NSCLC的分化程度密切相关，而与患者的年龄、性别和病理类型无相关性。Song等[12]应用免疫组化方法检测了174例食管癌中MTA1表达，发现MTA1在淋巴结转移患者的过度表达显著高于无淋巴结转移患者。

本研究应用免疫组织化学法检测186例NSCLC患者癌组织中和23例正常肺组织中MTA1蛋白的表达情况，MTA1在非小细胞肺癌的正常肺组织未见表达。在癌组织中的阳性表达者为103例（55.4%），与正常组织相比，差异有统计学意义（P < 0.01），提示了MTA1基因在非小细胞肺癌的发生和发展过程中起到了一定作用；而在不同性别、年龄及组织学类型中的表达差异无统计学意义（P > 0.05）。另外，本研究发现，MTA1蛋白在低分化癌组织中的阳性表达率明显高于中高分化组织（P < 0.05），说明MTA1蛋白表达与肺癌的分化程度密切有关，提示MTA1蛋白可能与抑制癌细胞的分化成熟有关；经临床病理分析发现，MTA1蛋白的表达水平与临床分期及淋巴转移有关，提示MTA1的表达与非小细胞肺癌的恶性程度、局部的侵袭转移及淋巴转移有关，MTA1高表达的非小细胞肺癌具有更强的侵袭及转移能力。

笔者进行的研究显示，TNM分期晚，并且有淋巴结转移的肺癌，MTA1、VEGF-C蛋白的阳性表达明显高于TNM分期早并且没有淋巴结转移者，尤其是两者相关性分析提示，非小细胞肺癌中MTA1表达与VEGF-C表达呈正相关关系，由此推断，MTA1与肺癌的发生、发展及淋巴结转移密切相关，其促进侵袭与淋巴结转移的机制可能与VEGF-C有关，但两者的进一步关系尚需实验研究来证实。

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（收稿日期：2012-07-02 本文编辑：郝明明）