水稻ERECTA基因组DNA的克隆及植物表达载体构建

作者简介：韩同凯（1987-），男，硕士研究生，研究方向为作物遗传育种。

通讯作者：陈翠霞（1964-），女，教授，研究方向为作物遗传育种。

谢先芝（1972-），女，副研究员，研究方向为植物发育生物学。

摘要：根据水稻ERECTA的cDNA序列（GenBank中的登陆号：Os06g0203800），利用NCBI的Blast工具找到OsERECTA所对应的基因组DNA序列（gERECTA），根据该序列设计2对特异引物，对gERECTA进行分段PCR扩增，并对前后两部分片段进行克隆、测序和拼接。本研究得到的gERECTA序列为8 901 bp，其中包括约17 kb的 5′区域和约300 bp 的3′区域。将拼接起来的gERECTA序列插入到pCAMBIA1390载体，经酶切和测序鉴定，证明重组表达质粒中带有gERECTA基因片段，表明gERECTA植物表达载体pCAMBIA1390-gERECTA已成功构建。

关键词：水稻；OsERECTA基因；克隆；植物表达载体

中图分类号：Q78 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2013）06-0004-07

水稻ERECTA基因是植物中编码富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶基因家族（Leucine-rich repeat receptor-like kinase gene family）中的一员。Torii等（1996）[1]首次克隆得到拟南芥ERECTA基因。拟南芥ERECTA基因在顶端分生组织、植株幼嫩的或正在生长的地上部分包括生长发育中的叶片和花器官中表达，在成熟器官和根中不表达，且在植株发育早期的顶端分生组织中表达较弱，但在营养生长向生殖生长过渡阶段表达水平提高[2]。

随着对模式植物拟南芥ERECTA基因研究的深入，发现ERECTA基因通过协调细胞分裂和细胞增殖调节包括花在内的气生器官结构（如节间和花梗的伸长和近轴-远轴极性）和气孔模式（如气孔密度和分布）[3～6]。已有报道证明拟南芥ERECTA基因调控某些生理过程如二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）的羧化率、电子传递能力、植株的蒸腾作用和水分利用效率等[6]。且ERECTA基因在植株对生物和非生物环境如热胁迫、干旱和细菌感染的响应中起作用[6～8]。

尹伟伦课题组克隆得到Populus nigra×（Populus deltoids×Populus nigra）ERECTA（PdERECTA）基因并培育了转基因拟南芥植株（35S∶ PdERECTA）。PdERECTA过表达导致苗期初生根变长、叶面积变大尤其是长期水分利用率（Long-term water use efficiency）大大增强，这揭示出ERECTA基因具有提高作物水分利用率的潜在作用[9]。朱锦程等利用RT-PCR技术从拟南芥中克隆得到ERECTA基因并构建真核表达载体pBin438-ERECTA，转化番茄，结果证实转基因番茄植株的水分利用率得到提高[10]。

大多数高等真核生物基因都含有内含子，其转录后的序列在剪接过程中从mRNA前体上切除。但很多情况下，内含子对基因的功能是非常重要的，可能同选择性剪接有关或者内含子本身包含了重要的非编码RNAs和ORFs。内含子具有增强基因表达的作用，例如，在过渡相实验（Transient assay）中，包含内含子的玉米乙醇脱氢酶1（Alcohol dehydrogenase-1）的表达量提高了50～100倍[11]。Karve等发现拟南芥ERECTA的表达强烈依赖内含子的存在，内含子是ERECTA基因mRNA积累所必需的[12]。因此，我们推测OsERECTA基因的表达同样需要内含子存在，本研究构建了包含内含子的ERECTA基因组DNA的植物表达载体。

1 材料与方法

11 试验材料

111 植物材料 水稻品种日本晴（Oryza sativa L cv Nipponbare）。样品为温室中生长2周的幼苗叶片，液氮速冻后置于-70℃保存，用于全基因组DNA提取。

112 试验试剂 限制性内切酶、DNA Ligase、DN段分子量标记（λ-EcoT 14 I digest）、BAP均购于TaKaRa公司；质粒小提试剂盒购于Bioteke公司；KOD-Plus-Neo DNA聚合酶购于ToYoBo公司；DNA胶回收试剂盒、卡那霉素（Kan）、氨苄青霉素（Amp）购于上海生工生物工程有限公司。

113 载体及菌株 克隆载体pMD18-T Vector、pTA2-T vector购于TaKaRa公司；表达载体pCAMBIA1390（CAMBIA， Canberra， Australia）由本实验室保存；E coli DH 5α由本实验室保存。pMD18-T Vector、pTA2-T vector具有Amp抗性；pCAMBIA1390具有Kan抗性。

114 引物设计 利用Primer Premier 50软件，选择得分较高、GC含量适中、无引物二聚体和发夹结构的引物对用于扩增水稻gERECTA基因序列；引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。

12 实验方法

121 PCR扩增 以全基因组DNA为模板进行PCR反应。使用KOD-Plus-Neo高保真酶（ToYoBo， Code： KOD-401），按照下列组成配成反应液（50 μl体系），反应液在冰上配制。PCR反应体系为：10× PCR Buffer for KOD- Plus- Neo 5 μl、2 mmol/L dNTPs 5 μl、25 mmol/L MgSO4 3 μl、20 μmol/L引物 （each） 075 μl、模板（Genomic DNA） 200 ng、KOD -Plus-Neo （1 U/μl） 1 μl，加ddH2O至总体积为50 μl。PCR反应条件如下：94℃预变性2 min；98℃变性10 s，（引物Tm值）退火30 s，68℃延伸3 min，35个循环。用10%（W/V）的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，并用DNA胶回收试剂盒回收目的片段。

122 重组克隆质粒的构建与鉴定 利用TaKaRa公司的pMD18-T Vector和pTA2-T Vector试剂盒将PCR产物与T载体连接，进行目的片段的克隆与鉴定。连接反应液包含1 μl pMD18-T Vector（或者pTA2-T Vector）、4 μl Insert DNA和5 μl Solution I。反应液混匀后于16℃连接反应45 min。将重组质粒转化E coli DH 5α感受态细胞，涂布于含Amp（100 mg/L）的LB平板培养基，37℃培养过夜，经抗性筛选后挑取单菌落。摇菌提取质粒后进行酶切鉴定，鉴定为阳性的质粒进行测序。

123 植物表达载体pCAMBIA1390-gERECTA的构建与鉴定 本实验构建表达载体的流程图见图1。

（1）载体pCAMBIA1390-DgERECTA的构建与鉴定：Hind Ⅲ和Spe Ⅰ双酶切阳性pMD18-DgERECTA，10%（W/V）琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的片段。利用DNA连接酶将目的片段定向连接到经同样处理的植物表达载体pCAMBIA1390中，转化E coli DH 5α感受态细胞，涂布于含Kan（50 mg/L）的LB平板培养基，37℃培养过夜，挑取单菌落。摇菌提取质粒后进行质粒双酶切鉴定，鉴定为阳性的质粒进行测序。

（2）UgERECTA连接到pCAMBIA1390-DgERECTA载体：Hind Ⅲ酶切阳性pTA2-UgERECTA，10%琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的片段。利用T4连接酶将目的片段连接到经同样酶切处理并经BAP（E coli C75）酶去磷酸化后的阳性pCAMBIA1390-DgERECTA载体中。转化E coli DH 5α感受态细胞，涂布于含Kan（50 mg/L）的LB平板培养基，37℃培养过夜，挑取单菌落。摇菌提取质粒后进行两次质粒单酶切鉴定，鉴定为阳性的质粒进行测序。测序正确的即为含有完整gERECT段的植物表达载体pCAMBIA1390-gERECTA。

2 结果与分析

21 特异性引物的设计

GenBank中的水稻OsERECTA基因cDNA序列所对应的基因组DNA序列（GenBank登陆号：AP0049913）全长为7 605 bp。利用Primer Premier 50软件分别设计两对特异引物，将gERECTA分为上游和下游两部分（UgERECTA和DgERECTA）。为了便于后续与表达载体的连接，在部分引物中设计了酶切位点和保护碱基。扩增UgERECTA序列的上游引物P1： 5′-CCCAAGCTTCAATAAACAAAGGCTAATCTTG-3′，下游引物P2： 5′-GAATTAAAATATCTTGAAAGCTTCAT-3′，下划线部分为Hind Ⅲ酶切位点（为gERECTA序列内固有的限制性酶切位点）。扩增DgERECTA序列的上游引物P3： 5′-AGGCTCTCGCTGTACTGTAAGTACAAT-3′，下游引物P4： 5′-AGACTAGTTAATACCAGTTCCAGCATTCCAATCCCAG-3′，下划线部分为SpeⅠ酶切位点。两对gERECTA基因特异引物设计示意图见图2A。

22 水稻DgERECTA和UgERECT段的分离

利用两对特异性引物分别扩增UgERECTA和DgERECTA两片段。根据gERECTA基因序列及两对引物的设计位点，预测DgERECT段大小为4 510 bp，含有约300 bp的3′区域，UgERECT段大小为4 483 bp，含有约17 kb的5′区域。PCR扩增产物经10%（W/V）琼脂糖凝胶电泳分离后，都分别得到一条比4 254 bp条带稍长的片段（图2B、C），与预期结果一致。

23 重组质粒pMD18-DgERECTA双酶切鉴定

将DgERECTA与pMD18-T载体连接，挑取经过Amp抗性筛选的6个单菌落，摇菌过夜后提取质粒，用Hind Ⅲ和SpeⅠ双酶切，10%（W/V）的琼脂糖凝胶电泳检测。预测阳性克隆酶切后应出现两条带，一条为2 692 bp的pMD18质粒片段；一条为4 444 bp的DgERECTA目的片段（引物P4到Hind Ⅲ之间的长度）。结果（图3A）表明，3、5号单菌落质粒出现了与预期结果相符的两条带，为阳性克隆。将酶切正确的重组克隆质粒进行测序，测序结果与已报道的序列完全匹配，并带有完整的酶切位点。表明酶切检测正确的重组克隆质粒pMD18-DgERECTA中含有正确的目的基因片段。

24 重组质粒pTA2-UgERECTA单酶切鉴定

将UgERECTA与pTA2-T载体连接，挑取经过Amp抗性筛选的6个单菌落，摇菌过夜后提取质粒，用Hind Ⅲ单酶切，10%（W/V）的琼脂糖凝胶电泳检测。预测阳性克隆酶切后应出现两条带，一条为2 981 bp的pTA2质粒片段；一条为4 483 bp的UgERECTA目的片段。结果（图3B）表明，1、4号单菌落质粒出现了与预期结果相符的两条带，为阳性克隆。将酶切正确的重组克隆质粒进行测序，比对结果表明插入的UgERECTA序列与已报道的序列完全匹配，并带有完整的酶切位点。表明酶切检测正确的重组克隆质粒pTA2-UgERECTA中含有正确的目的基因片段。

25 重组表达质粒pCAMBIA1390-gERECTA的构建

由于gERECTA基因片段较长，直接同pCAMBIA1390载体连接较为困难。因此，我们利用gERECTA基因序列内部的Hind Ⅲ酶切位点和人为添加的SpeⅠ 酶切位点，先将DgERECTA连接到pCAMBIA1390，再利用Hind Ⅲ酶切位点将UgERECTA连接到重组质粒pCAMBIA1390-DgERECTA上。由于插入的UgERECTA序列带有自身的启动子序列，所以gERECTA的表达受自身启动子的调控。

251 重组质粒pCAMBIA1390-DgERECTA的酶切鉴定 经Kan抗性筛选后的单菌落摇菌过夜后提取质粒，用Hind Ⅲ和Spe Ⅰ双酶切，10%（W/V）的琼脂糖凝胶电泳检测。预测阳性质粒酶切后应出现两条带，一条为8 864 bp的pCAMBIA1390质粒片段；一条为4 444 bp的DgERECTA目的片段。结果（图4A）表明，1～3号单菌落质粒出现了与预期结果相符的两条带，为阳性重组质粒。

252 重组质粒pCAMBIA1390-DgERECTA-UgERECTA的酶切鉴定 由于UgERECTA目的片段同pCAMBIA1390-DgERECTA连接反应是利用HindⅢ单一位点进行连接，所以pCAMBIA1390-DgERECTA重组载体去磷酸化反应要彻底，尽量减少载体的自连。连接反应前利用琼脂糖凝胶电泳检测回收UgERECTA目的片段和去磷酸化后的pCAMBIA1390-DgERECTA重组载体（图4B）。

对经Kan抗性筛选后的单菌落摇菌过夜后提取质粒，用Hind Ⅲ单酶切，10%（W/V）的琼脂糖凝胶电泳检测。预测质粒酶切后应出现两条带，一条为13 308 bp的pCAMBIA1390-DgERECTA质粒片段；一条为4 483 bp的UgERECTA目的片段。结果（图5A）表明，1、2、5、6、7号质粒为阳性重组质粒。由于这步连接反应只利用了Hind Ⅲ单一酶切位点，为检测UgERECT段插入到pCAMBIA1390-DgERECTA重组质粒上的方向性，我们利用SpeⅠ酶切检测1、2、5、6、7号质粒，预测连接方向正确的阳性质粒应出现一条7 960 bp的条带，连接方向颠倒的质粒出现一条5 483 bp的条带。结果（图5B）表明，2、5、7号质粒为连接正确的阳性重组质粒。

3 讨论

近年来，全球水资源短缺境况越来越严重，干旱造成农作物减产导致的经济损失逐年加重。植物可以通过诱导可溶性渗透调节物质的积累、膨压的维持或者耐脱水等抵抗干旱[13]，但是仅靠现有植物资源本身的调节能力抵御干旱已不能满足农业高产和稳产的需要。基因工程技术已逐渐渗透到植物的遗传改良研究中，与传统抗旱育种方法相比，基因工程以其周期短、效率高等特点得到越来越广泛的应用。

已有研究表明拟南芥ERECTA基因可以通过调控蒸腾效率来增强植株耐干旱胁迫的能力[11]。水稻是我国重要的粮食作物，改良水稻耐旱性是科学家育种的重要目标之一。构建能在水稻中表达OsERECTA基因的植物表达载体为培育抗旱水稻新品种提供了可能。为了便于研究OsERECTA基因在水稻生长发育中的作用，构建OsERECTA基因植物表达载体时要排除外源启动子对OsERECTA基因表达的影响。Dievart和Song等证明拟南芥ERECTA基因的启动子可表达拟南芥CLAVATA1和LhG4基因[14，15]，是相对较强的启动子。这同Karve等认为拟南芥ERECTA基因的上游序列作为强启动子起作用的结论一致[12]。因此，我们构建的pCAMBIA1390-gERECTA载体携带的OsERECTA自身启动子可以保证gERECTA基因过量表达，并具有同内源OsERECTA基因相同的表达模式，例如组织和器官特异性等，这比使用组成型启动子调控gERECTA基因的表达更便于研究OsERECTA基因的功能。

本实验通过基因工程技术手段，以日本晴全基因组DNA为模板，通过分段PCR扩增，克隆亚片段再连接的策略，成功分离并构建了包含水稻OsERECTA基因全长基因组片段的植物表达载体pCAMBIA1390-gERECTA，后续的基因转化工作正在进行，OsERECTA基因将在其自身启动子的控制下在转基因水稻中表达。本实验OsERECTA基因植物表达载体的构建为研究OsERECTA过表达对水稻生长发育及环境适应性方面的影响奠定了基础，也为研究水稻OsERECTA的功能奠定了基础。参 考 文 献：

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