Livin基因在非小细胞肺癌中表达的分子生物学特性

【关键词】 livin基因; 非小细胞肺癌; 分子生物学

原癌基因和抑癌基因所编码的蛋白存在于细胞的各个组成部分中，包括细胞核、细胞质、线粒体和细胞膜。通过对原癌和抑癌基因蛋白结构和功能的分析，发现许多原癌基因和抑癌基因位于信号通路中的不同部位，参与许多重要的细胞活动过程，如细胞生长和分化、dna复制和损伤修复、基因转录和表达、细胞周期调控等，在细胞凋亡、衰老过程中起重要作用，也在肿瘤的发生发展和转移中扮演重要角色。livin蛋白是新近发现的凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein，iap)家族的新成员之一，具有抗细胞凋亡作用，并明显地在肿瘤组织异性表达。目前的研究表明， livin基因在各系统的正常组织中很少表达，但在胚胎组织或发育组织、淋巴细胞性白血病、胃癌、膀胱癌、乳腺癌和黑色素瘤等多种组织中广泛表达。非小细胞肺癌（non?small?cell lung cancer，nsclc）的肿瘤细胞系中也有livin基因的表达，但其与肿瘤的发生、转移、耐药性等之间的确切关系尚不清楚。livin基因特异性地表达于肿瘤组织，有可能成为nsclc早期诊断的分子标志物，并为基因治疗提供新靶点［1-3］。本文就livin基因在nsclc中的表达及其抗细胞凋亡作用、信号传导途径与调节机制等分子生物学特性作一综述。

1 livin基因及蛋白结构功能的多样性

iap是一类重要的抗细胞凋亡因子，其共同的结构特征是n端含有一个或多个(最多为3个)串联的杆状病毒iap重复序列结构域(baculovirus iap repeats domain，birs)和c端含有一个环指结构域(ring finger domain，ring)。目前已发现人类iap家族有8个成员，即niap,xiap(ilp1/miha)，ciap1(hiap2/mihb)，ciap2(hiap1/mihc)，survivin(tiap)，apollon(bruce)，ilp2(tsiap) 和livin(ml?iap/kiap)［2］。

livin蛋白是iap家族的一个新成员，一些实验室采用iap同源序列(bir或ring)寻找的方法，分别从人类基因组cdna文库中克隆得到livin核苷酸序列，从不同的组织中发现了livin基因的表达。kasof等［3］在发育组织和肿瘤组织中发现并命名了livin基因。lin等［4］从人胎肾cdna文库中分离到该基因，故称其为kiap（kidney inhibitor of apoptosis protein，kiap）。vucic等［5］发现livin基因在g361 和 sk?mel29两种黑色素瘤细胞源株中高表达，将其命名为mliap（melanoma inhibitor of apoptosis protein）。ashhab等［6］发现了该基因存在2个剪接变异体（isoforms），分别命名为livin α和livin β。 同时，lin等［4］用荧光原位杂交方法确定livin基因位于人20号染色体20q13.3区域，全长4.6 kb，包含7个外显子。此外还发现存在长约2.2,2.8和4.0 kb的转录子，livin蛋白n端仅包含一个bir结构，包含4个α螺旋和一个三股抗平行 β片层，与相应的氨基酸残基共同构成疏水核心。c端含有一个ring环指结构［4,6］，氨基酸残基c124,c127,h44及c151与锌原子结合，借以稳定整个重叠结构。

livin蛋白有α和β两种变异体，分别由298和280个氨基酸组成，二者相差18个氨基酸，此区域由介于bir和ring结构之间的第6外显子5′端54 bp的基因序列编码。livin蛋白主要表达于胞质，但kasof等［3］认为livin蛋白的细胞内分布与survivin蛋白相似，livin蛋白既在胞质内呈丝状表达，同时也表达于胞核，并认为livin蛋白 c末端的ring结构对介导其在亚细胞水平上的分布具有重要作用。livin基因mrna 3′端非翻译区多腺苷酸化与存在未剪接加工成熟的前体rna有关，不同的剪辑有不同的变异体及亚型，这种结构基础有可能解释livin基因蛋白存在多个结构功能。如bir结构域内单个氨基酸的突变就能发挥其抗凋亡作用，作者的实验也发现在a549细胞中表达的livin 蛋白缺少66个核苷酸的变异体，其确切的功能意义尚不清楚。但livin基因蛋白结构的变化与其功能的多样性存在明显的相关性。

2 livin基因在nsclc中的表达

livin基因仅在少数正常组织中表达，各家报道的研究结果存在较大差异，目前还不能确定livin基因在人正常组织中的表达谱及其生理意义［2,7］。tanabe等［7］采用 rt?pcr法对15例正常肺组织和38例nsclc组织作对比研究，发现livin mrna在nsclc组织阳性率为73.6%，正常肺组织阳性率为6.7%，显示livin基因在nsclc中呈高表达，同时证明livin基因与survivin基因在nsclc中的表达并不相关。crnkovic?mertens 等［1,8］同时采用nsclc组织和nsclc源 hela细胞株培养检测livin基因及其两种异构体livin α和livin β的表达，结果显示livin α和livin β在nsclc中呈高表达。采用rnai技术分别使异构体基因沉默，发现livin β和livin α基因的功能意义不完全相同， livin β在细胞凋亡中起关键作用。国内崔肃等［9］采用rt?pcr法检测nsclc组织中livin α mrna和livin β mrna的表达，并用western blot方法分析livin蛋白的表达，结果显示45例nsclc组织中livin mrna表达阳性率为71.1％，两种异构体基本同时表达，livin β mrna的表达量略高于livin α mrna。而在癌旁正常肺组织和肺良性瘤样病变组织呈低表达，阳性率分别为5.7％和6.7％。而且livin mrna表达阳性标本中均能检测到livin蛋白表达。陈淼等［10］采用免疫组织化学(sabc)的方法检测livin蛋白在40例nsclc组织以及12例正常和肺良性疾病组织中的表达，结果显示22例腺癌和18例鳞癌组织中的livin蛋白阳性率分别为45.5?和50.0?，而正常肺组织和肺良性疾病组织均未检出livin蛋白表达。他们同时观察到不同分化程度nsclc组织之间livin蛋白的表达无显著性差异。有和无淋巴结转移的肺癌组织中livin蛋白表达的阳性率分别为72.7?和11.1?,两组的显著性差异标志着不同的生物学特性。孙建国等［11］ 的研究结果显示，48例nsclc组织中livin mrna表达阳性率为22.9%，其表达与nsclc组织学类型相关，腺癌中livin mrna表达阳性率达45.5%，明显高于鳞癌和大细胞癌，而癌旁组织和肺良性疾病组织均未检出阳性结果，而且livin 蛋白表达与mrna表达相一致。研究还发现放、化疗后nsclc组织中的livin表达的阳性率为43.5%，显著高于未放、化疗组织，提示放、化疗可明显诱导livin蛋白的表达，这可能与临床上nsclc对化疗药物和放疗耐受有关。

目前，livin基因在nsclc组织异性地高表达的现象已引起许多学者的关注［12］，但livin mrna的表达与nsclc患者的病理分型、肿瘤分化程度、淋巴结转移及tnm分期等的相关关系尚未完全阐明，livin基因作为nsclc的分子标志物，成为诊断和治疗nsclc新靶点的可能性已引起人们的极大兴趣。

3 livin抗细胞凋亡作用及其调节机制

kasof等［3,8］研究显示，livin蛋白n端的羧基与caspase?3,7,9的直接结合，阻断了caspase发挥凋亡作用的途径，从而抑制了细胞凋亡的发生。将livin基因转染hela细胞，受转染细胞内由fadd（fasassociated protein with death domain）,bax,rip,rip3及dr6诱导的细胞凋亡可被有效阻断。vucic等［13］将livin基因转染乳腺癌mcf7细胞，证实转染细胞对fas,tnfr?1（tumor necrosis factor receptor? 1）,dr4（death receptor 4）及dr5介导的细胞凋亡具有显著的抑制作用。许多化疗药物可导致肿瘤细胞dna的损伤而诱导细胞凋亡，转染livin基因的mcf7细胞可有效对抗阿霉素以及4tbp（4 tertiary butylphenol）诱导的细胞凋亡。但是各家报道livin α和livin β蛋白的抗细胞凋亡作用存在一定差异。yang等［14,15］观察在jurkat t淋巴细胞株中，livin基因可明显抑制由tnfα及抗cd95抗体诱导的细胞凋亡，其抗细胞凋亡作用强于bcl 2。livin α对sts诱导的jurkat细胞凋亡表现出一定的抑制作用，而livin β则无此作用。crnkovic?mertens 等［8］ 采用rna干扰技术分别使内源性livin α和livin β基因沉默，检测两者的抗凋亡作用，结果显示livin β可显著抑制依托泊苷（etoposide）和紫外线放射治疗（uv irradiation）等诱导的hela细胞凋亡，但livin α则不明显。更多的研究则认为livin α和livin β基因均具有抗细胞凋亡作用，二者可能具有不同的激活途径有待进一步证实。

许多研究证实［12-16］，livin蛋白介导细胞凋亡抑制存在不同的调节途径，通过与激活形式的caspase 3和caspase 7结合，抑制其活性。livin蛋白还可与未加工的或断裂形式的caspase 9结合，可抑制由apaf 1（apoptosis protein activating factor 1）、细胞色素c及datp诱导的caspase 9激活作用。 livin蛋白与caspase的结合抑制作用具有高度的特异性和亲和性，bir结构域内单个氨基酸的突变即可导致livin蛋白与caspase的结合作用的减弱或消失，致使livin蛋白抗细胞凋亡作用的明显降低甚至完全丧失，这也许可成为基因治疗的调节点。sanna 等［12］的研究显示，livin可激活map（mitogen activated protein）激酶jnk1和jnk2，但对jnk3无激活作用，而livin蛋白对jnk1的激活作用远远强于jnk2，并且这是livin蛋白对抗tnfα和ice介导的细胞凋亡作用的重要途径之一。 jnk蛋白家族可直接由mkk4/mkk7激活，但livin蛋白对jnk1的激活并不依赖于mkk4/mkk7信号途径，而是通过tab1/tak1途径实现。 tak1是map3激酶之一，在tgfβ1的刺激下tak1可激活jnk1。 tab1是tak1的共活化因子（coactivator），tab1本身对于jnk1无激活作用，但可促进tak1介导的jnk1激活作用。livin蛋白可与tab1结合，并进一步激活tak1。此外，vucic 等［13］证实smac（ second mitochondrial activator of caspases, smac）及活性肽片段可与livin蛋白的bir结构域特异性结合，抑制livin蛋白与caspase的结合及其抗细胞凋亡作用。因此存在着由smac介导的对livin蛋白抗细胞凋亡作用的负性调节机制。

4 livin基因治疗nsclc的临床应用前景

鉴于livin基因具有明显的抗细胞凋亡作用以及在肿瘤组织中的特异性表达，人们注意到其与肿瘤发生发展的关系，并开始探讨livin用于肿瘤基因治疗的可行性。应用基因转染技术可获得稳定表达livin α和livin β的nsclc a549细胞克隆。孙建国等［17］用平板克隆形成实验研究a549细胞生长情况，用mtt法检测其对放、化疗的敏感性，用细胞周期分析法观察细胞凋亡情况。结果发现转染livin α和livin β基因后的细胞尤其是表达livin α的a549细胞，克隆形成能力提高、倍增时间缩短，对多种化疗药物和放射线敏感性降低，10 gy放射线照射下仅有0.2%细胞发生凋亡。可见 livin基因参与nsclc的发生发展，也可能是nsclc细胞对放、化疗耐受的重要机制之一。

crnkovic?mertens等［18］利用基因转染和特异性小干扰rna(sirna)技术，在肺癌spc?a1细胞株中建立livin异构体α和β特异的基因沉默体系，观察诱导spc?a1细胞凋亡效应中的不同作用，并用tunel法和流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示内源性livin α和livin β基因沉默后，spc?a1细胞克隆形成能力较对照组显著下降，促使spc?a1细胞发生凋亡，表明livin α和livin β两种异构体均能作为诱导肺癌细胞凋亡的分子靶点，通过使livin基因沉默的靶向诱导肺癌细胞凋亡可作为手术、化疗、放疗等传统治疗的辅助手段。

由于livin基因仅在肿瘤组织表达而在正常组织极少表达，yagihashi等［19］用elisa法在肺癌患者外周血和肿瘤组织中均检测到自身livin蛋白抗体，其组织特异性显而易见。hariu等［20］ 用livin反义核苷酸片段刺激周围淋巴细胞，发现hla?a24与livin 7肽具有特殊亲和力，livin蛋白表达阳性的nsclc患者可检测到特异性细胞毒t淋巴细胞（cytotoxic t lymphocytes,ctls），而livin蛋白表达阴性nsclc患者则测不到ctls。结果提示livin蛋白可成为nsclc免疫治疗的靶点，将livin 7肽作为免疫制剂具有良好的应用前景。

综上所述，livin基因是肿瘤细胞凋亡途径中的一个信号调节点，其在nsclc组织中的特异性表达为nsclc的诊断提供了新的分子标记物，亦可成为nsclc治疗的新靶点［21，22］。目前，人们已能在基因水平上干预因基因表达异常而导致的疾病，尤其是以mrna为靶标的反义药物，可抑制和消除致病基因的表达，达到治疗的目点。因此，采用反义核苷酸（antisense oligonucleotides）、小分子抑制剂（small?molecule inhibitors）和免疫介入（immune?mediated approaches）等基因治疗手段直接阻断livin 蛋白与目的分子的结合，可以促使肿瘤细胞的凋亡，为nsclc的治疗开辟新的途径［23，24］。同时，对nsclc患者肿瘤组织和外周血免疫细胞的livin蛋白（受体）及其mrna表达的联合检测，有可能成为nsclc早期诊断、转移风险和预后的分子标记物。

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