山东小麦黄花叶病毒的分子检测与鉴定

【前言】山东小麦黄花叶病毒的分子检测与鉴定由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。Cong QianQian， Xu FeiFei， Li XiangDong*， Zhang GuangMin （Department of Plant Pathology， College of Plant Protection， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China） Abstract One hundred and five wheat samples collected from 10 distr...

摘 要：利用RT-PCR对2012年山东10个地区送检的105个小麦样品进行了检测，从泰安、临沂、枣庄3个地区的样品中检测到了小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）。这3个地区WYMV分离物CP基因的核苷酸一致率为976%～983%，氨基酸一致率为983%～99.0%。在利用CP基因核苷酸序列构建的系统进化树中，这3个分离物均与WYMV分离物聚类到一起，其中枣庄分离物和河南分离物（FR828007）亲缘关系更近。

关键词：小麦黄花叶病毒；CP基因；系统进化分析

中图分类号：Q781 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2012）11-0008-04

Molecular Detection and Identification of Wheat Yellow Mosaic Virus

in Shandong Province

Cong QianQian， Xu FeiFei， Li XiangDong*， Zhang GuangMin

（Department of Plant Pathology， College of Plant Protection， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China）

Abstract One hundred and five wheat samples collected from 10 districts of Shandong Province were detected for wheat yellow mosaic virus （WYMV） using RT-PCR. WYMV was detected from samples from Taian， Linyi and Zaozhuang. The coat protein genes of WYMV from these three areas shared the nucleotide identity of 97.6%～98.3% and the amino acid identity of 98.3%～99.0%. In the phylogenetic tree constructed based on the nucleotide sequence， the three isolates were clustered together with other WYMV isolates. The isolates from Zaozhuang had closer genetic relationships with the isolate from Henan.

Key words Wheat yellow mosaic virus； CP gene； Phylogenetic analysis

禾谷多黏菌（Polymyxa graminis L）是一种专性寄生于禾本科植物根部的低等真核生物，可以传播多种植物病毒，导致产量严重损失[1]。禾谷多黏菌传播的小麦病毒有小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）、中国小麦花叶病毒（Chinese wheat mosaic virus，CWMV）、小麦梭条斑花叶病毒（Wheat spindle streak mosaic virus，WSSMV）和土传小麦花叶病毒（Soil-borne wheat mosaic virus，SBWMV）等[2]。

2012年，在山东部分地区的冬小麦上发现了一种由禾谷多黏菌传播的病毒病，感病小麦植株表现矮化和黄化花叶等症状。本研究利用RT-PCR的方法，对山东10个地区送检的疑似小麦黄花叶病毒病的样品进行了检测，并对部分病毒分离物的外壳蛋白（CP）基因进行测序分析。

1 材料与方法

11 材料与试剂

疑似病毒病的小麦样品由泰安、临沂、青岛、烟台、德州、淄博、菏泽、枣庄、日照和威海等10个地市植保站提供，共105个样品。

试验所用TransZol购自TransGen公司；反转录试剂盒购自TransGen公司；RCR试剂、T4连接酶和pMD18-T克隆载体购自大连宝生物公司；回收试剂盒购自TransGen公司；其它化学试剂均为国产分析纯。

12 试验方法

121 植物总RNA的提取 参照TransZol试剂盒的（TransGen公司）说明，从新鲜的植物材料中提取总RNA。称取 02 g 样品于干热灭菌的研钵中加液氮研磨，加1 ml TransZol 剧烈振荡，静置5 min，加入200 μl氯仿剧烈振荡15 s，放置3 min，12 000 r/min离心15 min。取上清，加入500 μl异丙醇，12 000 r/min离心10 min。用 75% 乙醇洗涤沉淀，8 000 r/min离心5 min。室温晾干沉淀，加入50 μl溶解液溶解沉淀，-80℃保存。

122 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR） 根据已报道的WYMV、CWMV、BaYMV（大麦黄花叶病毒）、BaMMV（大麦和性花叶病毒）、WSSMV、SBWMV序列设计针对外壳蛋白编码区具有特异性的检测引物（表1）。以提取的总RNA为模板进行反转录，反应体系为20 μl。向不含RNA酶的02 ml离心管中加入 RNA 8 μl（约2 μg），10 μmol/L 反向引物（R端）1μl，2×TS Buffer 10 μl和TS Mix（含有M- mlV反转录酶和RNA酶抑制剂）1 μl。反转录程序为：42℃ 50 min；85℃ 5 min。

表1 本研究所用的检测引物引物名称 引物序列 扩增片段

长度（bp） 退火温

度（℃）

WYMV-F[3] 5′-GAGCTCATGGCAGCTGAC-3′ 905 55

WYMV-R 5′-AGGGGAGTACTGGTTTAGGTTAGT-3′

CWMV-F[4] 5′-ACATATGGCCGTGAAATCTGG-3′ 510 58

CWMV-R 5′-TGGATCCTCAACTCGAACCTTCCC-3′

BaYMV-F[5] 5′-CACGCGTTGTCACTCTACAA-3′ 803 56

BaYMV-R 5′-GGTCACCTTCTTACGCCTTT-3′

WSSMV-F[3] 5′-CGAGTACTGTATGCATTACGGTGGTTGTGA-3′ 1013 60

WSSMV-R 5′-CGAGTACTGATACAGATATACGACCAC-3′

SBWMV-F[6] 5′-TTTAAGCTATGGGCTAGTATGTTTAATTATAAGGG-3′ 1552 57

SBWMV-R 5′-CGGGGGGGATTTGAAC-3′

BaMMV-F[7] 5′-GATAGCCTTGTTGCACTACG-3′ 1135 52

BaMMV-R 5′-AACCTTTCCGGTATACA-3′

PCR 反应采用25 μl体系。含ddH2O 152 μl，10×PCR缓冲液 25 μl，dNTPs（每种25mmol/L）1 μl，反转录产物25 μl，10 μmol/L的正向（F端）和反向（R端）引物各1 μl，25 mmol/L MgCl2 15 μl，5 U/μl Taq DNA聚合酶 03 μl。反应条件为 ：94℃ 预变性5 min；然后94℃，30 s，每对检测引物的退火温度如表1，45 s，72℃，延伸时间按照1 kb/min，33个循环；最后 72℃ 终延伸10 min。

123 目的片段的回收、克隆及分析 PCR产物经1%的低熔点琼脂糖凝胶电泳，切下目的片段，用北京全式金公司的胶回收试剂盒回收目的片段。回收片段与 pMD18-T 载体连接，连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞。37℃ 培养14～16 h，挑取单菌落培养。提取质粒，PCR鉴定筛选重组质粒。含外源片段的重组质粒送上海博尚生物技术有限公司测序。

利用MegAlign软件比较所得序列与GenBank中WYMV CP基因序列的一致率，利用MEGA5构建系统进化树，以大麦黄花叶病毒（Barley yellow mosaic virus，BaYMV）的CP基因为外组，保留Bootstrap值大于50%的分支。2 结果与分析

21 样品检测结果

在105个样品中，利用引物WYMV-F和WYMV-R从泰安8个样品、临沂和枣庄各6个样品中扩增到约900 bp的片段，和预期大小一致。这些样品中不含其它病毒。其它样品中未检测到WYMV，也未检测到CWMV、BaYMV、BaMMV、WSSMV、SBWMV中的任何一种病毒。

22 WYMV CP基因序列测定及一致率分析

将从泰安、临沂和枣庄3个地区样品中扩增到的WYMV片段进行克隆和测序分析，证明扩增的片段包括905个核苷酸，其中CP基因882个核苷酸，编码293个氨基酸。

枣庄和临沂分离物CP基因的核苷酸和氨基酸一致率分别为976%和990%，枣庄和泰安分离物的核苷酸和氨基酸一致率分别为983%和990%，泰安和临沂分离物的核苷酸和氨基酸一致率分别为982%和983%。枣庄分离物与GenBank中其它WYMV分离物CP基因的核苷酸和氨基酸一致率分别为972%～993%和969%～997%，临沂分离物与GenBank中其它WYMV分离物CP基因的核苷酸和氨基酸一致率分别为972%～984%和969%～990%，泰安分离物与GenBank中其它WYMV分离物CP基因的核苷酸和氨基酸一致率分别为976%～994%和976%～997%。

23 系统发育关系分析

以BaYMV两个分离物（AJ224623，AJ224624）的CP基因为外组，根据泰安（TA）、临沂（LY）和枣庄（ZZ）3个分离物及GenBank上WYMV分离物的CP基因构建系统进化树（图1）。结果表明，泰安（TA）、临沂（LY）和枣庄（ZZ）3个分离物与其它WYMV分离物聚类到一起，形成许多与地理来源无关的姊妹分支。其中枣庄分离物（ZZ）与湖北罗田、武汉以及河南的分离物聚为一簇，并与河南分离物（FR828007）形成一个小的分支，说明二者之间的亲缘关系最近。

本研究利用RT-PCR的方法对山东10个地区疑似黄花叶病毒病的小麦样品进行了检测，结果只检测到了WYMV，表明WYMV是引起山东小麦黄花叶病的主要病毒。

本研究只从20个疑似黄花叶样品中检测到了WYMV，可能与WYMV的发生特点和取样时间有关。WYMV在20℃以上会隐症。样品送检的时间在4月底，此时气温已经较高，影响了对症状的判断。据报道，烟台、威海、青岛、临沂、潍坊和济宁等地也有禾谷多黏菌传小麦病毒病的发生，其中荣成市不夜村和黎明村、文登市、青岛市崂山区等地还有CWMV的发生[8～11]，而且CWMV和WYMV的发生面积和程度在不断变化中[12]。小麦上是否还有其他病毒的发生还需要加强检测和研究。

WYMV CP基因聚类结果表现出姊妹分支，说明这些分离物的CP基因序列一致率较高。需要加强对不同地区WYMV来源的研究，这对有效控制病害发生具有重要作用。参 考 文 献：

[1] 陈剑平， 阮义理 真菌传播植物病毒的证据[J] 浙江农业学报， 1991， 3（4）： 202-205

[2] 陈剑平 中国禾谷多黏菌传麦类病毒研究现状与展望[J]自然科学进展，2005， 15（5）：524-533

[3] 李大伟， 韩成贵 中国小麦黄花叶病毒（WYMV）分布的RT-PCR鉴定[J] 植物病理学报， 1997， 27（4）：303-307

[4] 张巧艳， 陈剑平 中国小麦花叶病毒（CWMV）生物学特性初探[J] 浙江农业学报， 2005， 17（3）：155-157

[5] 施农农， 陈剑平， Adams M J 中国大麦黄花叶病毒分离物的分子变异[J] 病毒学报， 1999， 15（4）：339-346

[6] Koenig R， Bergstrom G C， Gray S M， et al A New York isolate of Soil-borne wheat mosaic virus differs considerably from the Nebraska type strain in the nucleotide sequences of various coding regions but not in the deduced amino acid sequences[J] Archives of Virology， 2002， 147（3）： 617-625

[7] Monger W A， Clover G R G， Foster G D Molecular identification of Oat mosaic virus as a Bymovirus[J] European Journal of Plant Pathology， 2001， 107（6）：661-666

[8] 于善谦， 陈仲宜， 徐来升， 等 发生在我国的小麦黄花叶病毒病[J] 植物保护学报， 1986， 12（13）：217-219

[9] 罗瑞梧， 杨崇良 山东小麦土传花叶病的研究[J] 山东农业科学， 1982， 2： 6 -12

[10] 蔡文启， 彭学贤， 莽克强 山东崂山地区小麦花叶病的病原鉴定——我国的土传小麦花叶病毒（ SBWMV） [J] 植物病理学报， 1983， 13（4）：7-11

[11] 徐绍华， 蔡文启， 彭学贤， 等 感染土传小麦花叶病毒的小麦花叶病的电子显微镜研究[J] 植物病理学报，1984，14（2）：87-88

[12]孙炳剑，羊键，孙丽英，等 禾谷多黏菌传小麦病毒病的分布及变化动态[J] 麦类作物学报， 2011， 31（5）：969-973