毛细管区带电泳高效分离和高灵敏检测α乳清蛋白和β乳球蛋白

1引言

乳糖制品广泛用于食品及医药行业，如婴儿食品、人造奶油及糖果制品等。药用乳糖在医药行业的应用也日益增多，目前普遍作为药用填充剂或稀释剂用于药物生产中。然而，由于乳糖一般从牛奶乳清中提取，常因含有乳清蛋白等杂质而使其纯度降低。这些杂质蛋白的存在使得用药过敏的可能性大大增加，在注射用药中尤为突出。2010版《中国药典》特别增订了对乳糖有关检测的法定标准[5989811]，主要目的是保证药用乳糖中由杂质蛋白引起的过敏反应最小化。由此可见，在制药行业中的乳糖制品安全已经得以充分重视，而在食品行业亦如此。

本研究涉及的α乳清蛋白和β乳球蛋白是乳糖制品中的主要杂质，也是主要过敏原。因此，严格控制乳糖制品中二者的含量极为重要。本研究组的前期实验表明，高效液相色谱（HPLC）对二者的分离并不理想，且因紫外检测器的检测限较高而难以真正用于乳糖制品质量控制。目前为止，以HPLC技术对乳清成份的分析往往耗时较长[1，2]。而其它传统分析方法，如凝胶电泳法[3]及免疫法[4]等，均在方法成本、操作简单性或灵敏度方面不太理想。因此，发展一种灵敏、快速、高效的α乳清蛋白和β乳球蛋白分离检测方法十分必要。

近年来，毛细管电泳（CE）在大分子分离分析领域展现了独特的优势，其在生物领域及食品、药物质量控制领域中的应用也日益广泛[5，6]。目前使用CE技术进行蛋白分离的最主要问题之一是样品吸附等原因造成的分离性能和检测灵敏度下降[7]。解决这一问题的手段主要包括采用涂层毛细管[8，9]、使用极端pH条件、发展高灵敏度的检测方法以及样品的富集等。其中，高灵敏度检测方法主要有电化学检测、荧光检测和质谱（MS）检测方法，而样品富集技术一般可分为柱前富集和柱上富集[10～12]。通常使用紫外（UV）检测器可达到μmol/L量级的检出限[13]。而采用样品富集和激光诱导荧光（LIF）检测结合的方法，可使检测限降低至pmol/L～nmol/L水平[7，10，11，14]。在实际应用中，因UV检测方法简单、仪器普及率高、性能稳定、自动化程度高等优点而广泛使用。目前，蛋白质的高灵敏度检测多采用UV方法，如对牛血清白蛋白（BSA） 检出限可达到30 pmol/L[15]、通过柱前浓缩可实现的对肌红蛋白的1700倍富集[16]等，但这些方法所使用的样品处理步骤都较为复杂。采用简便快速的CE方法对α乳清蛋白和β乳球蛋白进行痕量分离检测至今未见报道。

本研究采用毛细管区带电泳（CZE）实现了对α乳清蛋白和β乳球蛋白的高效分离及高灵敏检测。通过使用优化的样品处理步骤及实验条件，有效避免了两种蛋白在毛细管内壁的吸附问题，二者峰形良好，在2 min内可实现基线分离。将本方法用于两种蛋白测定，线性范围和重现性均能满足要求。该方法已用于实际样品的分析，可成功区分经过一次精制的乳糖粗品和二次精制的乳糖制品，可望在乳糖制品杂蛋白检测领域得到更广泛的应用。

2实验部分

2.1仪器与试剂

Aglient3D HPCE毛细管电泳仪 （美国安捷伦科技公司），仪器控制、数据采集与处理由安捷伦化学工作站软件 ChemStation（版本B.01.03）完成；熔融石英毛细管（50 μm I.D. × 38.5 cm，有效长度30 cm，河北鑫诺公司）；万分之一分析天平 （日本岛津公司）；雷磁pHS3C型精密pH计 （上海精密科学仪器有限公司）。

α乳清蛋白和β乳球蛋（中国食品药品检定研究院提供），乳糖制品（供注射用，重庆药友制药有限公司提供）。甲醇、乙腈及异丙醇（色谱纯，美国Dima公司）。其它试剂均为国产分析纯，所有溶液均以去离子水配制，并在使用前经0.45 μm的纤维素滤膜过滤。

2.2电泳条件

新毛细管在使用前用1 mol/L NaOH冲洗10 min，H2O 冲洗5 min，背景缓冲溶液冲洗4 min； 每两次运行之间用1 mol/L NaOH冲洗3 min，H2O 冲洗1 min，背景缓冲溶液冲洗4 min， 以保证重现性。每4次进样后更换缓冲液。仪器运行条件为：电压+30 kV，毛细管温度25 ℃， 紫外检测波长205 nm，压力进样5 kPa

2.3样品制备

精确称取适量α乳清蛋白和β乳球蛋标准品，溶于水，即为标准样品溶液。乳糖制品处理方法如下：称取0.500 g样品，溶于1.00 mL水，涡旋混匀后，超声20 min（超声温度不超过25 ℃），2000 × g离心1 min，取上清液进行分析，进样前样品于4 ℃保存。

3结果与讨论

3.1CZE条件的优化

蛋白质大分子在毛细管内壁上的吸附问题一直是制约CE在生物大分子领域应用的主要瓶颈问题。有关测量乳品中蛋白质的报道通常只用毛细管内壁涂层的方法对蛋白吸附进行抑制，如孟序等[17]曾使用聚丙烯酰胺和聚丙烯醇涂层毛细管对乳品中的6种蛋白进行分离分析，但其背景缓冲溶液成分相对复杂，并需对蛋白质进行变性处理。本研究采用CE模式中分析速度快、消耗低、体系最简单的CZE模式，利用未涂层的熔融石英毛细管、简单的背景电解质及简单的样品处理方法对乳糖制品中的α乳清蛋白和β乳球蛋白进行分析。

对两种等电点相近、清疏水性质相近、而空间结构及蛋白表面所含活性基团略有不同的蛋白大分子的分离而言，在首先解决蛋白在毛细管内壁的吸附的前提下，还需调整合适的背景电解质体系，使得二者迁移时间的差别足以保证基线分离。实验条件的优化主要集中于对背景电解质成分、浓度及pH值、毛细管长度及内径、样品处理方法及进样方式、分析电压及温度等方面。最终通过实验参数的系统优化，两种组分在电压+30 kV，毛细管温度25 ℃，25 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）的条件下，2 min内得到了快速、高效的基线分离，并可达到令人满意的检测灵敏度（图1）。

3.2方法评估

3.3实际样品测定

在实际乳糖样品的测定中，采用上文所述样品处理方法，在高、中、低3种浓度下测定方法回收率，可得二者的加标回收率分别为α乳清蛋白71%、β乳球蛋白50%。经样品处理后，可定量检出初次精制的乳糖粗品中这两种蛋白（图2），并没有观察到样品基质的干扰，可见方法选择性及灵敏度均可达到实际检测的要求。而在二次精制的乳糖成品中，未

4结论

本研究建立了简单、快速、灵敏、稳定的CZE方法，在不使用涂层毛细管及复杂的背景电解质条件下，2 min内实现了乳糖中的α乳清蛋白和β乳球蛋白的高效分离及高灵敏检测。与同类方法相比，本方法的灵敏度明显提高，并能用于实际样品的分析。样品处理方法的回收率合理，方法重现性好。本方法由于简单、灵敏、稳定，可望在乳糖领域乃至其它食品行业有更多应用。

需要指出，本方法并没有完全抑制β乳球蛋白在毛细管内壁的吸附，以至于该蛋白的检出限比较高（12 mg/L）。这可能是由于β乳球蛋白表面活性基团与毛细管内壁硅羟基作用较复杂，在该缓冲体系下不能被有效抑制所致。可以预测，如果不追求方法的简单性，向背景电解质中引入其它合适的添加剂，加之其它实验参数的合理调整，即可有效抑制β乳球蛋白在毛细管内壁的吸附，改善峰形，进一步降低检出限。此外，采用毛细管内壁修饰的方法，也可有效避免多种蛋白的管壁吸附，如以羧甲基壳聚糖动态涂敷的方法对毛细管进行适当处理后，亦可实现这两种蛋白的高灵敏度分离检测[9]。这类方法为CZE在食品安全领域的广泛应用提供新的思路。另一方面，以质谱作为检测器也更加丰富了CE的分析效率，提供更多的结构信息及更高的灵敏度[18]。但是，目前CEMS联用技术仍在稳定性和仪器接口的成熟度上尚待改进。

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