毛细管区带电泳化学发光法测定食品中残留的磺胺类药物

摘要：基于碱性介质中，磺胺类药物对Ag配合物与鲁米诺（Luminol， Lu）化学发光体系的发光强度有抑制作用，建立了毛细管电泳化学发光分离检测磺胺甲f唑（Sulfamethoxazole， SMZ）、磺胺二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine， SDM）、磺胺噻唑（Sulfathiazole， ST）的方法。3种磺胺类药物经毛细管电泳分离后，分别与Ag配合物和鲁米诺化学发光体系作用，以相对迁移时间定性，相对化学发光强度定量，采用标准曲线法测定样品中的待测物含量。对影响毛细管电泳的分离与化学发光检测的条件均进行了优化。在最佳分离检测条件下，3种磺胺类药物在2.0～200 μg/mL范围内线性良好（r>0.9977）。对3种磺胺类药物平行测定7次，相对标准偏差（RSD）为1.3%～1.9%，3种磺胺类物质的检出限分别为0.33， 0.20和0.034 μg/mL，加标回收率为80.2%～102.9%。将本方法应用于猪肉、鸡肉、牛奶中的3种磺胺类药物残留量检测，结果令人满意。

关键词 ：毛细管电泳； 化学发光； Ag配合物； 磺胺类药物

1 引 言

磺胺类药物（Sulfonamides， SAs）是一类广谱抑菌药物，性质稳定、价格低廉，作为兽药广泛用于家畜饲料中，用于预防和治疗家畜疾病。这些药物进入动物体内后， 可残留在肉、蛋、奶等动物性食品中，并会在食用者体内蓄积，影响其健康。磺胺甲f唑（Sulfamethoxazole， SMZ）、磺胺二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine， SDM）、磺胺噻唑（Sulfathiazole， ST）是常用的磺胺类药物，其残留能引起中毒或过敏性反应，并被怀疑有致癌性[1，2]。因此，建立一种操作简便、快速、准确的磺胺类药物残留检测方法，对于动物源性食品的安全监测具有重要意义。

已报道的磺胺类药物主要检测方法为高效液相色谱法，检测器为紫外、荧光及质谱检测器[3～14]。色谱法需要使用大量有机溶剂， 且仪器价格昂贵、运行成本高。近年来，毛细管电泳（Capillary electrophoresis， CE）做为一种高效的分离技术被广泛研究。由于其设备简单，效率高，溶剂和样品的使用量少，运行成本相对较低，使CE相比其它方法更具吸引力[15，16]。化学发光（Chemiluminescence， CL）作为CE检测系统，具有以下特点：灵敏度高；成本低廉，组装简便；不需要光源，避免了杂散光对测定的影响。因此，将CL的高灵敏度与CE的高分离效率相结合，具有一定的优势[17，18]。

在前期工作中，本研究组将Ag配合物与鲁米诺组成化学发光体系，并与流动注射和毛细管电泳相结合，用于测定血尿样本和药物制剂中的皮质醇、多巴胺、肾上腺素及去甲肾上腺素等[19～22]。本研究中，将高灵敏的化学发光体系作为毛细管电泳的检测系统，用于检测动物源性食品中兽药残留。采用固相萃取净化浓缩样品后，利用毛细管电泳进行分离，并采用化学发光检测系统进行检测， 方法简便、快速， 结果令人满意。

2 实验部分

2.1 试剂与药品

SMZ，SDM和ST（德国Dr. Ehrenstorfer公司）。鲁米诺（日本TCI公司）；甲醇（色谱纯，Honeywell Burdick & Jackson公司）。其它试剂均为优级纯（北京化学试剂厂）。

SMZ，SDM和ST储备溶液：称取适量SMZ，SDM和ST标准品，溶于0.01 mol/L NaOH溶液中，以超纯水定容。鲁米诺储备液：称取适量鲁米诺标准品，溶于1.0 mol/L NaOH溶液中，以超纯水定容。

2.2 毛细管电泳化学发光检测装置

本实验所用仪器为自行组装毛细管电泳化学发光检测装置， 如图2所示。此装置由高压电源提供电压，光电倍增管收集化学发光信号。分离毛细管（65 cm×50 μm i.d.）、试剂引入毛细管（40 cm ×200 μm i.d.）和反应毛细管（15 cm×530 μm i.d.）由三通接头连接固定。将分离毛细管的一端（约7 cm）烧去聚酰亚胺涂层，经HF刻蚀45 min后，插入反应毛细管中。反应毛细管烧去约1 cm聚酰亚胺涂层，作为检测窗口，反应毛细管的刻蚀端插入到检测窗口处，氧化试剂以重力方式引入毛细管，形成同轴环流，在检测窗口处与分离毛细管末端流出的还原试剂混合，产生化学发光，检测窗口固定于光电倍增管前。化学发光反应系统与光电倍增管等密封于暗箱中。

实验开始前，先冲洗活化石英毛细管。依次用0.1 mol/L NaOH、超纯水冲洗10 min后，再用运行缓冲液（硼砂和NaOH）平衡约20 min，进行电泳。新的石英毛细管在使用前需要进行简单处理，依此用1 mol/L NaOH冲洗30 min，0.1 mol/L HCl冲洗10 min，超纯水冲洗20 min。

2.3 样品处理

猪肉和鸡肉样品：依据国家标准方法[25]处理。 称取样品（5±0.05）g，于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加乙酸乙酯20 mL重复提取，合并两次提取液于鸡心瓶中，加入4 mL 0.1 mol/L HCl ，于40℃下旋转蒸发浓缩至少于3 mL，转至10 mL离心管中，用2 mL 0.1 mol/L HCl和3 mL正己烷依次冲洗鸡心瓶，转至同一离心管中，涡旋混和30 s，3000 r/min离心5 min，弃正己烷相，取下层液备用。

牛奶样品：根据国家标准方法[26]，取样品（5±0.05）mL，置于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入25 mL HClO4溶液（pH 2），于涡旋振荡器振荡提取1 min，超声波萃取10 min，备用。

SCX固相萃取柱：依次用2 mL甲醇和2 mL 0.1 mol/L HCl活化。取备用液过柱，依次用1 mL 0.1 mol/L HCl和2 mL 50%（V/V）甲醇乙腈溶液淋洗，用4 mL 5%（V/V）氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，于40℃氮气吹干，1 mL 0.1 mol/L NaOH溶液溶解残余物，0.45 μm滤膜过滤，待测。

Oasis HLB固相萃取柱：使用前在柱上塞上一小块脱脂棉，再依次用3 mL甲醇和5 mL HClO4（pH 2）活化，取备用液过柱，再用5 mL超纯水淋洗，抽干，用3 mL甲醇洗脱。收集洗脱液，于40℃氮气吹干，1 mL 0.1 mol/L NaOH溶液溶解残余物，0.45 μm滤膜过滤，待测。

3 结果与讨论

3.1 化学发光信号的优化

SMZ，SDM和ST对AgLuminol化学发光体系的发光信号有明显抑制作用。本研究对检测体系中 Ag配合物溶液的浓度及pH值、鲁米诺的浓度等参数进行了优化。

3.1.2 鲁米诺浓度的优化

考察了鲁米诺浓度（1.0～4.0 mmol/L）对化学发光信号的影响（图 5）。结果表明，随着鲁米诺浓度逐渐增大，化学发光信号先增强后逐渐减弱。为了兼顾3种磺胺类物质都能在最强的化学发光条件下进行检测，鲁米诺的最优浓度选择为2.0 mmol/L。

在CECL检测系统，SMZ，SDM和ST由分离毛细管通过重力作用引入，在缓冲溶液的作用下进行分离。缓冲液溶液中硼砂及NaOH通过影响溶液的pH值及离子强度，最终影响电泳的分离效果及化学发光的信号强度。结果表明，硼砂浓度可影响迁移率及CL信号。硼砂浓度在2～15 mmol/L范围内，随着其浓度的增高，SAs的分离效果提高（图6）。此外，考虑到对分离效果和信号强度的影响，在保证3种磺胺类药物完全分离的前提下，选择能得到最强化学发光信号的浓度作为最优浓度，即硼砂浓度为12 mmol/L。为了达到更好的分离效果，对运行缓冲液的pH值进行了优化。结果表明，当NaOH的浓度范围为1.0～10 mmol/L（pH 9.2～9.6）时，随着NaOH浓度增加，分离效果明显提高（图7）。当NaOH浓度为8 mmol/L（pH 9.5）时，SMZ，SDM和ST分离效果最好。

3.3 石英毛细管管长、电泳电压及进样时间的选择

从理论上讲，石英毛细管管长和分离电压均可影响SAs的迁移速率和分离效果[27，28]，研究结果表明，实验考察了石英毛细管长度范围为50～75 cm，当石英毛细管为65 cm时，可达到较好的分离效果。石英毛细管长度一定时，随着分离电压的增高，迁移时间缩短，在一定的范围内，柱效随电压增大而增高，但随着分离电压的不断升高，柱内的焦耳热增加，柱效反而下降，缓冲液的黏度减小。电压考察范围为5～20 kV，在保证中3种磺胺类药物分离效果最好的前提下，最佳电压为18 kV。

虹吸进样是常用的毛细管电泳进样方式。当进样时间太短时，常会使进样精密度变差；而进样时间长时，毛细作用引起的自发进样的差异对进样量的影响降低，但进样时间不宜太长，否则会增加样品塞的长度，使柱效和分离度降低。因此，只要检测器能够提供足够大的信号，进样区带宜越小越好[28]。实验考察了进样时间的范围为5～26 s，结果表明，当进样时间达到18 s时，可获得稳定的化学发光强度及较好的峰型。

3.4 分析检测线性范围、精密度与检出限

在优化条件下，对3种磺胺类物质系列标准溶液进行检测，线性范围、回归方程、精密度以及检出限等参数见表1。检出限的峰高值为3倍的基线噪声（S/N=3），定量限为10倍的基线噪声（S/N=10）。

3.5 样品分析

在优化的条件下，即Ag配合物溶液浓度为0.05 mmol/L，Ag配合物溶液中NaOH浓度为0.01 mol/L（pH 12.1），缓冲溶液中鲁米诺浓度为2.0 mmol/L，硼砂浓度为12 mmol/L，NaOH浓度为8.0 mmol/L（pH=9.5），对已处理的猪肉、鸡肉和牛奶样品进行了测定（图8）。猪肉、鸡肉和牛奶样品均购买于当地市场及超市。分别取猪肉、鸡肉、牛奶各9份，共27份样品，检测结果为未检出，同时采用国家标准方法[25，26]进行了比对，结果均为未检出。动物在正常使用量下，磺胺类药物的休药期是8～20天，休药期后组织内含量可达到MRL水平及以下，但当过量或长时间使用下动物组织内会大量蓄积。本检测结果为未检出，可能原因为未使用磺胺类药物或已过休药期。

3.6 回收率实验

取猪肉、牛奶样品各9份， 在其中依次加入3种磺胺类标准品，每份样品按照样品前处理的方法进行处理，制得低、中、高3种浓度的加标样品，每份样品平行测定3次，计算回收率，回收率为80.2%～102.9%之间见表2。在同样的加标水平下，国家标准方法的回收率为83.0%～99.2%。本方法及国标HPLC法分别加标MRL含量，经单点校正法测定，回收率分别为81.5%和83.3%。

3.7 Ag配合物鲁米诺化学发光体系检测机理推断

根据该体系的前期研究推断[19，21]，可能的化学发光反应机理为：碱性介质中，作为氧化剂的Ag配合物与鲁米诺组成化学发光体系， Ag配合物氧化鲁米诺产生化学发光，即为基线信号。SMZ，SDM和ST均对Ag鲁米诺体系化学发光有抑制作用。Ag配合物和鲁米诺及本研究的3种磺胺类物质的反应均为自由基反应，且3种磺胺类物质与Ag反应较鲁米诺与Ag的反应慢得多，反应过程中鲁米诺产生的自由基一部分转移给磺胺分子，从而使鲁米诺自由基不同程度的减少，发光体的量减少，使得体系的发光强度不同程度的降低。

4 结 论

采用固相萃取法对猪肉、鸡肉以及牛奶样品进行净化和富集，通过毛细管电泳分离，Ag配合物鲁米诺化学发光新体系的化学发光检测器进行检测，建立了CECL法同时对动物源性食品中3种磺胺类药物残留进行分离检测方法，同时对Ag配合物鲁米诺化学发光新体系的可能检测机理进行了探讨。方法避免了使用大量有机试剂，仪器组装简单、成本低廉，检测灵敏度高，为动物源性食品中磺胺类兽药残留的检测提供了一种快速简单、灵敏的检测手段。

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Abstract Based on sulfonamides inhibited the chemiluminescence （CL） intensities of the system consisting of Ag complexes with Luminol （Lu） in basic medium， a method for capillary electrophoresis （CE）CL separation and determination of sulfamethoxazole （SMZ）， sulfadimethoxine （SDM） and sulfathiazole （ST） was established. The three kinds of sulfonamides were separated by capillary electrophoresis， and reacted with Ag complexesLuminol CL system， respectively. In the relative migration time， the relative CL intensity was quantitative and the standard curve method was used to determine the content of the analytes in the sample. The conditions for the separation and chemiluminescence detection system were all optimized. Under the optimized conditions， the linear ranges for the determination of SMZ， SDM and ST were 2.0-200.0 μg/mL （r>0.9977）， with detection limits （S/N=3） of 0.33， 0.20 and 0.034 μg/mL， respectively. Relative standard deviation （RSD） values for the peak height were 1.3% to 1.9% （n=7）. The proposed method was applied to the determinations of sulfonamides residues in pork， chicken， milk samples with satisfactory results.

Keywords Capillary electrophoresis； Chemiluminescence； Silver complex； Sulfonamides