流式细胞仪法与磁性酶联免疫吸附法检测HLA―B27的对比研究

【摘要】 目的：对比分析磁性酶联免疫吸附法与流式细胞仪法检测AS患者HLA-B27的临床价值。方法：选取2010年5月-2013年5月笔者所在医院门诊及住院疑诊为AS患者164例，分别应用磁性酶联免疫吸附法和流式细胞仪法检测HLA-B27，以临床诊断为参照，对比分析两种方法的特异性、敏感性及准确性等指标。结果： 164例疑诊为AS患者中，确诊143例，排除21例。以临床诊断为参照标准，流式细胞仪法及磁性酶联免疫法敏感性分别为96.5%、84.6%，两方法敏感性比较差异有统计学意义（字2=11.820，P=0.001）；特异性分别为71.4%、95.2%，流式细胞仪法特异性低于磁性酶联免疫吸附法（字2=4.286，P=0.038）；准确性分别为93.3%、86.0%，两种方法比较差异有统计学意义（字2=4.725，P=0.030）；关于阳性预测值及阴性预测值，两种方法比较差异无统计学意义（字2=2.887，P=0.090；字2=0.625， P=0.419）。结论：磁性酶联免疫吸附法及流式细胞仪法各有优缺点，两者结合对早期AS的诊断有着重要的参考价值。

【关键词】 流式细胞仪法； 磁性酶联免疫吸附法； 强直性脊柱炎； HLA-B27

中图分类号 R593.23 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2014）22-0052-03

Comparative Study of the Flow Cytometry Method and Magnetic Enzyme Linked Immunosorbent Assay for Detection of HLA-B27/ZHU Jian-ming.//Chinese and Foreign Medical Research，2014，12（22）：52-54

【Abstract】 Objective：To analyze the clinical value of flow cytometry method and magnetic enzyme linked immunosorbent assay for detection of HLA-B27 in paitients with ankylosing spondylitis（AS）.Method：164 patients with suspected AS were chencked with the flow cytometry method and magnetic enzyme linked immunosorbent assay for detection of HLA-B27 from May 2010 to May 2013 in our hospital.The clinical diagnosis results being served as a reference，the sensitivity，specificity，accuracy，positive predictive value and negative predictive value of two methods were analyzed.Result：143 cases were diagnosed and 21 cases were excluded in 164 cases of suspected AS patients.The clinical diagnosis being severed as the reference standard，the sensitivity of flow cytometry method and magnetic enzyme linked immunosorbent assay were 96.5%，84.6%.The specificity of two methods were 71.4%，95.2%，and the accuracy was 93.3%，86.0%.There were significant differences between two methods（字2=11.820，P=0.001；字2=4.286，P=0.038；字2=4.725，P=0.030）.About the positive predictive value and negative predictive value of two methods there were no significant differences between two methods （字2=2.887，P=0.090；字2=0.625，P=0.419）.Conclusion：Magnetic enzyme linked immunosorbent assay and flow cytometry method have their respective advantages and disadvantages，and two methods together have an important reference value for AS.

【Key words】 Flow cytometry； Magnetic enzyme linked immunosorbent assay； Ankylosing spondylitis； HLA-B27

First-author’s address：Haizhuqu District Rainbow Street Community Health Service Center of Guangzhou City，Guangzhou 510280，China

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis， AS）是一种慢性、进行性和高致残性的自身免疫性疾病。其特征性病理变化为肌腱、韧带附着点炎症，主要累及部位为脊柱、骶髂关节，以椎间盘纤维环及其附近纤维化、骨化、关节强直、活动受限为病变特点的慢性炎症性疾病，也可累及内脏及其他组织[1]。AS由于临床症状与腰椎间盘突出症、骶髂关节炎、腰背肌筋膜炎等相似，临床上容易误诊漏诊，往往不能早期治疗，最终导致关节强直、废用，给患者带来终生痛苦。因此，探索早期诊断和鉴别诊断方法，对及早治疗AS、预防病情恶化具有重要的价值。研究发现人类白细胞抗原B27（human leucocyte antigen-B27，HLA-B27）与强直性脊椎炎具有高度相关，HLA-B27已成为诊断和鉴别诊断AS的重要证据[2]。目前关于HLA-B27常用的检测方法有微量淋巴细胞毒试验、酶联免疫吸附法、序列特异性引物-聚合酶链式反应法、流式细胞仪检测法（FCM）等[3]。2010年5月-2013年5月笔者应用磁性酶联免疫吸附法（IMS-ELISA）及FCM检测疑诊为AS的患者HLA-B27，以临床诊断为参照，对比分析两种方法的特异性、敏感性及准确性等，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年5月-2013年5月笔者所在医院门诊及住院疑诊为AS患者164例，男116例，女48例，年龄14～80岁，男女比为3.1∶1。所有患者检测前均未接受柳氮磺胺嘧啶、甲氨蝶呤及其他免疫抑制剂等药物的治疗。临床诊断标准参照1984年修订的纽约标准[4]，排除晚期AS患者（X线片显示关节出现骨性融合）；其他原因引起的骨关节病变；妊娠期或哺乳期女性患者及恶性肿瘤患者等。

1.2 方法

所有患者清晨空腹抽取静脉血4 ml，分装在两支EDTA抗凝管中，各2 ml，24 h内分别应用磁性酶联免疫吸附法和流式细胞仪检测HLA-B27。磁性酶联免疫法采用美国Goldsign公司HLA-B27抗原磁性酶联免疫试剂盒，酶免疫检测仪为上海科华公司的KHBsT-360型号；在主波长450 nm、副波长630 nm下读取其吸光度值（OD），OD

1.3 观察指标

以临床诊断为参照标准，比较分析两种方法的敏感性、特异性、准确性、阳性预测价值及阴性预测值。注：敏感性=检测真阳性/（真阳性+假阴性）×100%，特异性=检测真阴性/（真阴性+假阴性）×100%，阳性预测价值=检测真阳性/（真阳性+假阳性）×100%，阴性预测值=检测真阴性/（真阴性+假阴性）×100%，准确性=检测真阳性+检测真阴性/（真阳性+假阳性+真阴性+假阴性）×100%。

1.4 统计学处理

3 讨论

强直性脊柱炎是一种与遗传相关的自身免疫性疾病，多见于青壮年，对青壮年（特别是男性）身体健康危害很大，多有家族聚集倾向[5]。具体发病机制目前不清，主要可能与遗传及机体免疫功能紊乱有关[6]。现阶段有效治疗手段有限，目前治疗药物大多临床疗效差，且往往有很大的毒副作用，大多患者多受疾病的折磨，严重影响着AS患者的日常生活及身心健康。国内外文献报道其发病率为1%～3%，近年来发病率呈逐年上升趋势，且有发病趋于年轻化的趋势[7]，在我国的患病率为0.25%～0.4%，男女比例约4∶1，发病高峰年龄在16～31岁[8]。AS起病隐匿，病程进展缓慢，临床表现复杂多样，早期表现多与慢性腰肌劳损、急慢性腰背肌筋膜炎、腰椎退行性病变、椎间盘突出症、骶髂关节炎等相类同；另影像学早期改变往往不典型，初发者在X线片上基本没有脊柱及骶髂关节病变的改变，在临床工作中容易误诊和漏诊，等出现临床上X线片所见的特征性脊柱及骶髂关节改变时，已失去了治疗时机，AS患者约1/3最终出现永久性关节功能丧失。因此对AS进行早期诊断及和控制住病情的进展、减轻畸形、维持和改善功能，具有非常重要的意义。对AS早期诊断的研究方向，应该是尽可能在肯定的影像学特征性征象出现之前寻找可靠精准的检查方法。上世纪70年代Brewerton等研究发现人类组织相容性I类抗原HLA-B27与AS发病密切相关，陆续有研究发现90%以上AS患者表达HLA-B27，而正常人群中HLA-B27阳性率仅为4%～7%[9]。HLA-B27抗原是由一种Ⅰ类主要组织相容复合体（MHC）基因编码的抗原分子，相对分子量为57 kDa，由α链和β2m链组成的二聚体，HLA-B27抗原几乎表达于所有有核细胞及血小板表面，特别是免疫系统淋巴细胞表面，其主要功能是传递多肽给CD+8T细胞。人类白细胞抗原（HLA）是体内具有高度多态的抗原系统，HLA-B27是HLA-B位点上的一个重要等位基因，研究发现它与很多疾病的发生密切相关，对HLA-B27与AS之间如何关联及HLA-B27在AS的发病中的作用目前尚不清楚，但其与AS的发病高度相关为学者接受[10]。

目前关于检测HLA-B27检测主要包括两大类，即抗原检测法和基因检测法。常用方法有淋巴细胞毒试验、酶联免疫吸附法、流式细胞仪法、特异序列引物-聚合酶链式反应法及各种特殊聚合酶链式反应法等，前三种为抗原检测法，特殊聚合酶链式反应是基因检测法，关于各种方法的敏感性、特异性及准确性报道参差不一。2010年5月-2013年5月笔者应用磁性酶联免疫吸附法及流式细胞仪法检测疑诊为AS的患者，以临床诊断为参照，对比分析两种方法的特异性、敏感性及准确性等指标，结果显示流式细胞仪检测法及磁性酶联免疫吸附法敏感性分别为96.5%、84.6%，两种方法比较差异有统计学意义（P=0.001）；特异性分别为71.4%、95.2%，流式细胞仪检测法低于磁性酶联免疫吸附法（P=0.038）；准确性分别为93.3%、86.0%，流式细胞仪法准确性高于磁性酶联免疫吸附法（P=0.030）；阳性预测值及阴性预测值，两种方法比较差异无统计学意义（P>0.05）。从以上结果可以得出，流式细胞仪检测法的敏感性及准确性高，但特异性不高，磁性酶联免疫吸附检测法特异性高，但敏感性及准确性不及流式细胞仪检测法。关于流式细胞仪检测法的结果与既往文献报道相似[11]。流式细胞仪检测法特异性不高，与流式细胞法所用的单克隆抗体有关，流式细胞仪法在检测HLA-B27时，单克隆抗体会与多种其他HLA抗原，如HLA-B7、HLA-B22等发生交叉反应（特别是HLA-B7），对检测结果造成影响，出现假阳性，从而使特异性下降。现有研究者应用HLA-B7/B27双色标记或HLA-B27及其亚型HLA-B2708双抗体检测，以减少干扰反应[12-14]。流式细胞仪法缺点就是需要昂贵的仪器设备、耗材及试剂，人员需要专门技术，且需要新鲜的血样本，不适于基层医疗单位推广。然而流式细胞仪检测法的特点是快捷、简便、省时且敏感性高，适合于大规模样本的检测筛查。磁性酶联免疫吸附分析法是利用免疫磁性技术和酶联免疫吸附法相结合，通过磁性分离技术分离经HLA-B27特异性抗体包被的全血中带有HLA-B27抗原的白细胞，经酶底物液显色而测定HLA-B27抗原[15]。本研究结果显示磁性酶联免疫吸附分析法特异性较流式细胞仪法高，两种方法的阳性预测价值和阴性预测价值无明显区别，两种方法检测结果符合率也很高，同时磁性酶免疫吸附分析法同流式细胞仪法相比还具有较高的敏感性和特异性，不失为一种检测HLA-B27有效的实用的方法。磁性酶联免疫吸附分析法的优点为操作简便，耗时短，结果稳定、客观，标本仅需抗凝全血50 μl，不需特殊设备、适合批量测定，也可单份使用等，磁性酶联免疫吸附分析法对基层医疗单位是一种实用而可靠的检测方法[16]。

综上所述，磁性酶联免疫吸附法及流式细胞仪检测法各有优缺点，对早期及不典型清阴性脊柱关节病的诊断有着重要的参考价值。磁性酶联免疫吸附法特异性高，流式细胞仪法敏感性高，在有条件的单位两者可联合应用，提高诊断的准确率，如条件不允许，可优选磁性酶联免疫吸附法做筛查，必要时再行流式细胞仪法检查或其他方法如各种特异聚合酶链式反应法印证。另外，需指出的是HLA-B27抗原检测阴性的患者，不能排除AS，HLA-B27抗原阳性也不一定是AS，只有综合临床症状、体征及X线等相关检查，综合考虑，做出正确的诊断。

参考文献

[1]顾松琴，韩静.流式细胞术与补体依赖性微量淋巴细胞毒试验检测强直性脊柱炎患者HLA-B27的比较[J].青海医药杂志，2012，42（12）：1-3.

[2]陈慧毅，褚为靖，张会英，等.实时荧光PCR法与流式细胞术两种方法检测HLA-B27的比较[J].中国实验诊断学，2012，16（12）：2251-2254.

[3]许卫星，胡玉弘.三种方法检测人类白细胞抗原-B27的比较[J].河北医学，2010，16（4）：397-399.

[4]张乃峥.临床风湿病学[M].上海：上海科学技术出版社，1999：165-166.

[5孙芳.人类自细胞抗原-B27检测在临床诊断强直性脊柱炎中的应用价值[J].国际检验医学杂志，2010，31（11）：1301-1302.

[6]黄宝英，杨菁，富显果，等.HLA-B27基因亚型分型检测[J].中国实验诊断学，2013，17（6）：983-985.

[7]巫翠萍，覃西，赵莲.HLA-B27在诊断早期强直性脊椎炎中的应用价值[J].海南医学，2011，22（23）：19-21.

[8]赵晓君，薛鸾，陈云飞，等.三种方法检测强直性脊柱炎患者HLA-B27的效果比较[J].山东医药，2011，51（43）：48-49.

[9]杨菁，富显果，唐宝佳，等.序列特异引物聚合酶链反应在HLA-B27检测中的应用[J].国际检验医学杂志，2013，34（13）：1645-1646.

[10]蒋叙川，卢峰.HLA-B27检测在强直性脊柱炎中的临床应用[J].内蒙古中医药，2012，31（11）：91-98.

[11]陈春伟，陈海霞.流式细胞术检测HLA-B27抗原的表达及临床意义[J].中国医学工程，2010，18（1）：39-40.

[12]裴兵.探讨流式细胞术检测HLA-B27在强直性脊柱炎中的临床应用价[J].实验检验医师杂志，2012，4（1）：31-34.

[13]Darke C，Coates E.One-tube HLA-B27/B27208 typing by flow cytometry using two “Anti- HLA-B27” monoclonal antibody reagents[J].Cytometry B Clin Cytom，2010，78（1）：21-30.

[14]黄建民，李荣需，周玲，等.强直性脊柱炎与HLA-B27基因亚型动态定量表达的相关性研究[J].中国医学创新，2013，10（32）：143-145.

[15]刘波，邱萌.早中期强直性脊柱炎患者两种检测HLA-B27方法比较[J].中国医药导报，2011，8（13）：47-48.

[16]罗玲，严海燕，罗晓红.HLA-B27/B7抗原检测在诊断强直性脊柱炎中的临床价值[J].中国实用医药，2013，8（4）：8-9.

（收稿日期：2014-04-21） （编辑：程旭然）