磁场联合CTX对小鼠抗肿瘤指标的影响

引 言

恶性肿瘤是当今危害人类健康最严重的疾病之一，已成为仅次于心血管疾病的世界第二号杀手。目前，恶性肿瘤的治疗方法主要有手术、放疗和化疗，其中，化疗是近年来进步最快的治疗方法。化疗利用化学药物杀死肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞的生长繁殖并促进肿瘤细胞的分化，但是化学药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对机体产生较大的毒副作用。分析大量临床病例可见，不少患者的死亡不是因为癌症本身，而是由于不科学、不恰当的杀伤性治疗所致。例如：肺癌患者胸水化疗后因呼吸衰竭而死亡；胃癌、肠癌患者化疗后恶心、呕吐，有的甚至因衰竭而死亡；患者化疗后会出现白血球下降，可能因感染而死亡等。因此，如何提高肿瘤对药物的敏感性并减轻药物的不良反应，在肿瘤治疗中越来越受到人们的重视。磁场是磁体、电流、运动电荷或变化电场周围空间存在的一种特殊形态的物质，可对在其中运动的电荷施加作用力，从而显现出一系列磁现象。随着磁共振理论的发展和波谱技术的应用，静磁场在人们生活中的应用越来越广泛，尤其是近来磁悬浮列车的运用及核磁共振成像技术在医学临床上的应用。因此，高强度静磁场的生物效应也日益引起人们的关注[1～3]。随着磁场生物效应研究的深入，人们把目光投向了静磁场对肿瘤细胞的抑制效应。国内外研究表明, 一定强度的静磁场处理可以抑制肿瘤的生长[4,5]。作为物理辅助疗法，磁疗技术已应用于临床，并具有操作简单、见效快、副作用小、无痛苦等优点[6]，成为肿瘤新疗法的可行发展方向。据报道，物理方法结合药物治疗肿瘤，特别是磁场结合抗肿瘤药物共同治疗，可以增强抗肿瘤药物杀伤肿瘤细胞的效果。Sabo 等[7]将 HL-60 细胞置于 1 T 的静磁场中72 h，发现细胞生长受到了抑制，然后，他们将细胞分别与 5- 氟尿嘧啶 (5-FU)、顺铂、阿霉素和长春花碱混合，并在 1 T 静磁场下暴露相同时间，结果表明，药物与磁场的联合作用比单纯磁场或药物的抑制效果好得多。那么，将静磁场和化疗药物联合作用于荷瘤小鼠，是否如同大多数体外实验的结果一样，能够协同地抑制肿瘤的生长呢？静磁场能否通过发挥其对机体的生物效应，从而减轻化疗药物所造成的毒副作用呢？针对以上问题，我们将 12 T 超强静磁场 (ultra strong staticmagnetic field，USMF) 和化疗药物环磷酰胺 (cyclophosphamide，ctx) 共同作用于 S180荷瘤小鼠，研究其对荷瘤小鼠的抗肿瘤、免疫、抗氧化和骨髓抑制性等方面的影响。

材料和方法

材料与仪器

实验动物体重(20±2) g的昆明种雄性小鼠和S180 腹水型荷瘤小鼠均购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK (沪) 2007-0005。

试剂

注射用 CTX 购自江苏恒瑞医药股份有限公司；苏木精 - 伊红 (HE) 染液购自南京建成生物工程研究所；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、过氧化氢酶 (catalase，CAT)、超氧化物歧化酶( super oxide dismutase，SOD)、总抗氧化能力 (total antioxidation capability,T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；RPMI 1640 培养基、MTT、台盼蓝和刀豆蛋白(Con A)为Sigma 公司产品；10%胎牛血清购于兰州明海生物公司。

仪器

所用的主要仪器有：KX-21N 型血液分析仪 (美国希森美康医用电子有限公司)，UV-2102-PC型紫外扫描仪(上海尤尼柯仪器有限公司)，CA-920-3 型超净工作台 (上海上净净化设备有限公司)和 550 型酶标仪 (美国 Bio-Rad 公司)。

强磁场设备

所用的磁场设备为英国 OXFORD 公司出品，采用超导强磁体，用液氦和液氮联合方式冷却，可在工作空间中产生竖直方向的稳定超强磁场，磁场中心的感应强度在 0～14 T 间连续可调，其精度可达0.0001 T。超导强磁体的工作空间是一个竖立的圆柱形通孔，内径80 mm，长度 1174 mm，在工作空间的轴向方向上，磁场中心±40 mm 范围内的磁感应强度比较均匀，工作空间的温度为室温。照射前，用直径 3.0 cm、长 8.0 cm 的 PVC 透明管将小鼠身体固定并悬挂于磁场中心，保证小鼠全身都能受到12 T 稳定强静磁场的辐射。

实验方法

S180荷瘤小鼠模型的建立

将 S180 腹水型荷瘤小鼠脱颈处死，在超净台内吸取腹水，光学显微镜下计数并调整细胞浓度为 2×107/mL。将调整好浓度的腹水接种于小鼠右前肢腋窝皮下，0.1 ml/ 只，建立S180肉瘤荷瘤小鼠模型；接种于小鼠腹腔，0.1 ml/ 只，建立 S180 腹水型荷瘤小鼠模型。动物分组及处理将 40 只 S180 肉瘤小鼠随机分为 4 组，每组 10 只，分别为对照组、USMF 组、CTX 组和 USMF+CTX 组。其中，CTX 组每天腹腔注射浓度为 300 mg/mL 的 CTX 溶液 (注射体积为10 ml/kg)；对照组每天腹腔注射等体积的生理盐水；USMF 组每天置 12 T 静磁场中 2 h，并腹腔注射等体积生理盐水；USMF+CTX组每天置 12 T 静磁场中 2 h，并腹腔注射 CTX30 mg/kg。连续处理 7 天。40 只腹水瘤小鼠分组处理方法同肉瘤小组，连续处理 7 天后，正常饲养直至死亡，用于生存时间的分析。

抗肿瘤能力的测定

相关指标的观测

第9 天，将 S180 肉瘤小鼠脱颈处死，剥离干净皮下肿瘤组织，拍照并称瘤重 (精确到0.01 g)，根据公式 〔抑瘤率(%)=(对照组平均瘤重－治疗组平均瘤重)/ 对照组平均瘤重×100%〕计算各组的抑瘤率。腹水瘤小鼠分组处理后，正常饲养。每天在固定时间观察小鼠的生存情况，记录每只小鼠的死亡时间。小鼠全部死亡后，对各实验组小鼠的生命延长率进行统计学比较。生命延长率(%)=(对照组平均生存时间－治疗组平均生存时间)/ 对照组平均生存时间×100% 。

组织学观察

每组选取三个肉瘤组织用多聚甲醛固定，20%和 30%蔗糖溶液浸泡沉底后以最大切面取材，冷冻切片机切片，切片厚度为 12 μm，并进行 HE 染色。染色流程为：苏木精染色15～20 min自来水流水冲洗1%盐酸乙醇液分色自来水蓝化蒸馏水漂洗一次伊红染色 4 min自来水冲洗 10 min剃度酒精脱水 (70%、80%、90%、100%、100%，5 min/次) 二甲苯透明两次(5 min/次) 中性树脂封片。普通光学显微镜观察，并用数码相机采集图像。

骨髓抑制性的测定

剥离小鼠左侧后肢大腿股骨，用眼科手术剪将股骨两端剪断，露出骨髓腔，用 10 ml0.05 mol/L 的 CaCl2冲洗骨髓至离心管中，4℃冰箱中放置 30 min 后，2500 r/min 离心15 min；弃上清，加入 0.2 mo1/L 的 HClO4溶液5 ml，振荡混匀后，90℃加热 15 min；用流水冷却至室温后过滤，滤液经紫外分光光度计测定268 nm 的吸光度 A 值，以检测荷瘤小鼠骨髓细胞DNA 的含量。

荷瘤小鼠抗氧化能力的测定

将S180 肉瘤小鼠脱颈处死，取小鼠的肝脏和肾脏，准确称取并按 1∶9 的重量体积比加预冷的生理盐水，配制成10%的组织匀浆，3000 r/min 离心 15 min，取上清。严格按照试剂盒说明检测 MDA 的含量、T-AOC，以及 CAT、SOD 和 GSH-Px 的活力。

免疫能力的测定

胸腺和脾脏指数的测定

将小鼠脱颈处死，称体重，取胸腺和脾脏，用电子天平精密称重，计算胸腺和脾脏指数。小鼠胸腺或脾脏指数(mg/g)= 胸腺或脾脏重量(mg)/ 体重(g)

小鼠脾脏中淋巴细胞转化率的测定

将小鼠脱颈处死，无菌取脾，剔除脂肪组织和结缔组织后剪碎，经 200 目筛过滤至离心管中，用 PBS 缓冲液洗涤 3 次，每次洗涤后离心 l0 min (3000 r/min)，然后将细胞悬浮于2 ml的完全 RPMI-1640 培养液中，用台盼蓝染色计数活细胞，并调整细胞浓度为2×107cfu/mL，制成脾细胞悬液。将细胞悬液移至96 孔培养板中，每孔 100 μl，做 6 个复孔，每孔加 10 μl Con A 液(100 μl/mL)，另 6 孔加等体积的完全 RPMI-1640 培养液作为对照，置 37℃温浴箱中培养72 h。培养结束前 4 h，加入 MTT (5 mg/mL)，15 μl/ 孔，继续培养 4 h。培养结束后，每孔加150 μl SDS三联液，培养过夜，用酶标仪在570 nm 处测定 OD 值。淋巴细胞转化率(%)=(Con A 孔 OD 值－对照孔 OD 值)/ 对照孔 OD 值×100%

小鼠外周血中白细胞数目的测定

将 S180 肉瘤小鼠摘眼球，取血约 1 ml，置于含 EDTAK2 和 EDTAK3 抗凝剂的血常规管中，血液分析仪检测小鼠外周血中白细胞的数目。

数据处理

采用SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析。所有的数据均用 mean±SD 表示，两组间比较用t检验方法分析，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异具有显著性，P＜0.01表示差异具有极显著性。

结 果

实验动物数量分析

共纳入 80 只小鼠，过程中死亡两只，78 只小鼠进入最后的结果分析。

抗肿瘤能力的测定

与对照组相比，USMF 组肉瘤小鼠的瘤重和生存时间均无显著变化 (P＞0.05)，抑瘤率为8.62%，生命延长率为 2.90%；CTX 组与对照组相比，瘤重明显减少，生存时间延长(P＜0.01)；与CTX 组 51.53%的抑瘤率和 20.29%的生命延长率相比，USMF+CTX 组的抑瘤率(72.53%)增加了0.41 倍 (P＜0.05)，生命延长率 (51.30%) 提高了 1.53 倍 (P＜0.01)。如表1 所示。可见，USMF 与 CTX 联合作用可以协同性地抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长。对各组肉瘤小鼠的肿瘤组织进行组织学切片，HE 染色结果如图 1 所示。切片镜检发现：对照组肿瘤组织中的肿瘤细胞密集，间质少，肿瘤细胞边界清楚，细胞核较大且深染；CTX 组和 USMF＋CTX 组肿瘤细胞呈大片状红染无结构的坏死，间质纤维相对较丰富，肿瘤细胞明显减少，细胞核深染固缩，核质比减少；USMF 组也可观察到肿瘤细胞的坏死。

骨髓抑制性的测定

各组小鼠的骨髓 DNA 含量如图 2 所示。与对照组相比，USMF 组骨髓 DNA 含量增大约为对照组的 1.14 倍 (P＜0.05)；CTX 处理则明显减少了骨髓细胞的 DNA 含量 (P＜0.05)，仅为对照组的0.76 倍。这说明，CTX 会对机体造成骨髓抑制性，USMF 的加入缓解了 CTX造成的骨髓抑制，但差异不显著(P＞0.05)。

抗氧化能力的测定

小鼠肝脏抗氧化能力的测定

小鼠肝脏组织匀浆中CAT、SOD和 GSH-Px 的活力、T-AOC，以及 MDA 的含量如表2所示。由表2可知，USMF组的MDA含量 (0.6nmol/mg prot) 比对照组 (0.9nmol/mg prot)减少了 33.7%，CTX 组 (1.43 nmol/mg prot) 比对照组增加了 55.4%，USMF+CTX 组比 CTX组减少了 39.9% (P＜0.05)；与对照组相比，USMF 组的 GSH-Px 和 USMF+CTX 组的 CAT、GSH-Px活性及 T-AOC 均显著上升 (P＜0.05)，而 CTX 组的 SOD 活性和 T-AOC 明显降低(P＜0.05)。与CTX 组相比，USMF+CTX 组的 CAT 和 SOD 的活力及 T-AOC 不同程度地增强(P＜0.05或 0.01)。这些结果说明，CTX 会造成小鼠肝脏的氧化损伤，而 USMF 与之联合则具有明显的损伤修复作用。

小鼠肾脏抗氧化能力的测定

小鼠肾组织匀浆中CAT、SOD 和 GSH-Px 的活力、T-AOC，以及 MDA 的含量如表 3所示。结果显示，CTX 组的 MDA 含量 (1.9 nmol/mg prot) 比对照组 (1.4 nmol/mg prot) 增加了 36.0% (P＜0.01)，而 USMF+CTX 组 (1.5 nmol/mg prot) 比 CTX 组显著减少了 21.6%(P＜0.05)；与对照组相比，USMF 组的 CAT 和 SOD 活力明显增强 (P＜0.05），USMF 组的T-AOC (0.8 U/mg prot)比对照组(0.7 U/mg prot)增长了 20.0% (P＜0.01)，USMF+CTX 组的SOD 活性和 T-AOC 均显著上升 (P＜0.05)；CTX 组的 GSH-Px 活力 (362.9 U) 比对照组(441.5 U)降低了17.8% (P＜0.05)；与CTX 组相比，USMF+CTX 组的 SOD 和 GSH-Px 活力显著增强(P＜0.05)。

免疫能力的测定

如表 4 所示，USMF 照射可显著增大荷瘤小鼠的脾淋巴细胞转化率和白细胞数目 (P＜0.05或 0.01)；CTX 则明显对机体造成免疫抑制，小鼠的脾脏指数、胸腺指数、脾淋巴细胞转化率和白细胞数目均显著减少(P＜0.05或0.01)；CTX+USMF 组的脾脏和胸腺指数，以及白细胞数目不同程度地下降(P＜0.05或0.01)；CTX+USMF 组的胸腺指数、脾淋巴细胞转化率和白细胞数目均比 CTX 组显著增大 (P＜0.05)，改善了 CTX 处理造成的机体免疫低下状况。

讨 论

已有研究发现，磁场和化疗药物联合作用的抗肿瘤效应比单独使用磁场或化疗药物时更强[9]。不过，研究仅局限于低强度静磁场的生物效应，且大多数是体外实验的结果。我们实验研究了 12 T 静磁场结合 CTX 对 S180 荷瘤小鼠的影响，并取得了与以往研究相一致的结果，即 USMF 与 CTX 可以协同性地抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，延长其生存时间。为了进一步探究其作用机理，我们还观察了各组小鼠肉瘤组织的切片，发现USMF 与 CTX 联合处理后，肿瘤组织内产生更多坏死区，肿瘤细胞减少。这与陈淼等[10]的研究结果相符。因此推测，USMF 增强 CTX 对肿瘤的抑制作用，可能是因为 USMF 抑制了肿瘤组织的血管和肿瘤间质成分的生成。血液中携氧的血红蛋白中含有铁离子，是顺磁性物质，而生物组织一般是与之相反的逆磁性物质，USMF 作用可能会使血红蛋白难以进入肿瘤组织，从而不能进行正常的血氧交换，造成肿瘤组织长期慢性缺氧，减少了对肿瘤的营养供应。而肿瘤组织的快速增殖过程对供血和供氧的要求又高于正常组织，所以，USMF 可扰乱组织供血，易造成肿瘤组织的坏死，从而增强了 CTX 对肿瘤组织的损伤。CTX的毒副作用大，易引发肿瘤细胞的抗药性[11]，并常常造成患者免疫力低下、骨髓抑制和脏器损伤等问题，这极大地限制了其临床运用。有文献报道，稳恒磁场可减轻 CTX的部分副作用，提高抗肿瘤药物的细胞毒性作用[12]。机体的免疫功能与肿瘤的发生有密切关系[13]。本研究发现，USMF 能够明显增加 CTX治疗中荷瘤小鼠的脾脏和胸腺指数、脾淋巴细胞转化率及白细胞数目，这说明它能够对抗CTX所致的白细胞下降及免疫器官萎缩等副作用，增强了机体的免疫能力，进而发挥抗肿瘤能力。我们推测，可能是由于镶嵌在细胞膜上的大分子、基团和离子，以及生物体内的自由基一般都带有电荷，在磁场中会受到洛仑兹力的作用，改变了细胞膜表面的电荷分布，导致一些生化和生理过程的变化，进而影响了细胞的生物学行为，引起多种生物磁效应[14]。骨髓是机体重要的造血器官，其 DNA 含量可反映其增殖活性和细胞功能的强弱。本实验发现，USMF 能显著增加荷瘤小鼠骨髓的 DNA 含量，而 CTX 组的骨髓 DNA 含量显著减少。说明 USMF 与 CTX 联合处理能在一定程度上改善 CTX 造成的骨髓增殖抑制状况。其作用机理目前还不清楚，有待进一步的研究。生命系统内部的新陈代谢及与环境物质和能量的交换，均会产生大量的自由基。有实验表明，癌症患者体内SOD 和 GSH-Px 的活力明显下降，清除自由基的能力降低[15]，因此，自由基代谢水平与肿瘤的发生和发展可能有着密切联系[16]。本实验结果与上述研究结果基本一致，发现 CTX 作用显著增大了荷瘤小鼠肝脏和肾脏中 MDA 的含量，并抑制了抗氧化酶的活力，而 USMF 与 CTX 联合作用则明显降低了 CTX 治疗中的 MDA 含量，并增大了CAT、SOD和 GSH-Px 的活力，这说明 USMF 能够改善 CTX 造成的氧化损伤，进而抑制肿瘤生长。其作用机理可能是由于自由基是带有不配对电子的顺磁性物质，具有自旋磁矩，会受到磁场的吸引[17]，因此，磁场能直接作用并影响自由基参与生理及病理活动。

综上所述，USMF 持续辐射与 CTX 可协同地抑制 S180 荷瘤小鼠肿瘤的生长，并一定程度上减轻 CTX 对机体的毒副作用，为其临床应用提供了一定的理论依据。但其作用的具体微观机制目前还不明确，尚需进一步研究。