参竹心康汤对慢性心衰大鼠心肌纤维化及Smad2的影响

摘要：目的 观察参竹心康汤对慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化的干预效果，并与卡托普利比较，探讨参竹心康汤对慢性心力衰竭心肌纤维化的影响及相关机制，以期为评价中药对慢性心力衰竭的疗效及研究提供一客观依据，并为参竹心康汤的进一步深入研究和市场推广奠定理论基础。方法 72只SD大鼠随机分为六组：假手术组、模型组、卡托普利组、参竹心康汤小剂量组、参竹心康汤中剂量组、参竹心康汤大剂量组，每组12只。采用腹主动脉缩窄法制作心衰大鼠模型。造模成功后，假手术组、模型组以蒸馏水10ml/kg灌胃，卡托普利组以卡托普利混悬液7.8mg/kg灌胃，小剂量组、中剂量组、大剂量组分别以中药煎液11g/kg、22g/kg、44g/kg灌胃，1次/d，连续灌胃8w。放射免疫法检测大鼠心肌Smda2水平、碱水解法检测心肌组织羟脯氨酸（HYP）含量。结果 模型组Smad2与HYP 水平明显高于假手术组，卡托普利组、 参竹心康汤组上述指标均明显低于模型组。结论 参竹心康汤有抗慢性心力衰竭心肌纤维化的作用，其机制可能与抑制Smad2表达有关。

关键词：慢性心力衰竭；心肌纤维化；Smad2；参竹心康汤

慢性心力衰竭（CHF）是由于各种器质性或者功能性心脏疾病损害心室充盈或射血功能的一组综合征，是多种心血管疾病的严重阶段[1]，也是多数器质性心脏病患者难以避免的结局[2]。随着生活质量的改善和人口老龄化的进展，CHF的患病人数也日益增加，给国家和社会带来沉重的负担。CHF的患病率和死亡率很高并正在逐年增加[3]，其对社会的影响也相当大，因此积极探讨心衰的治疗，发挥中医药的作用势在必行。

目前认为CHF是一种细胞因子参与的神经内分泌过度激活的临床综合征，心室重塑是导致心力衰竭的基本机制[4]，心室重塑包括心肌肥厚和心肌间质纤维化，心肌纤维化（MF）和CHF有着密切的联系，已成为心衰治疗的新靶标[5]。

参竹心康汤是笔者多年临床经验的结晶，其前期研究已证明参竹心康汤能有效的治疗CHF[6]，其治疗CHF的机制是否和抗心肌纤维化有关，及其抗心肌纤维化的效果和可能的机制还未行相关研究，故现拟通过参竹心康汤治疗CHF大鼠，以腹主动脉缩窄法（AAC）复制大鼠心力衰竭模型，以羟脯氨酸（HYP）为检测MF的指标，探讨参竹心康汤对Smad2的影响，明确依据益气养阴、活血化瘀法组方的参竹心康汤对慢性心力衰竭心肌纤维化的疗效及相关机制，以期为评价中药对CHF的疗效及研究提供一客观依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康雄性SD 大鼠72 只，清洁级，体质量（220±10）g。购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号 SCXK（湘）2013-0004，动物合格证号（006737）。常规饲料饲养，自由饮水。

1.2主要药品 参竹心康汤：党参20g、麦冬10g、黄芪20g、五味子6g、玉竹15g、丹参20g等。中药饮片由我院附属医院按照2010年《中华人民共和国药典》规定购入，由湖南省中医药研究院附属医院药剂科制备成含生药4.5g/ml的中药煎液，自然冷却后置于4℃冰箱冷藏备用。卡托普利片：湖南湘雅制药有限公司，批号为20130024。购置卡托普利片后研磨成极细粉末，加入蒸馏水中制备成浓度为3.25mg/ml的混悬液，然后置于4℃冰箱冷藏备用。

1.3主要试剂和仪器 大鼠Smad2试剂盒：武汉华美生物工程有限公司。Hyp试剂盒：南京建成生物工程研究所。紫外分光度计： 购自美国UVP公司。水平电泳仪（GE-100型）： 杭州大和热磁电子有限公司。电子天平（FA型）：上海台之衡电子衡器有限公司。高速微型离心机：德国Eppendorf公司。NABILA175型低温冰箱：日本松下电器公司产品。

1.4分组和模型建立 所有实验大鼠在湖南省中医药研究院动物实验中心适应性饲养1w，随机分为六组：假手术组，模型组，卡托普利组，参竹心康汤低、中、高剂量组，每组12只。参照文献方法[7]，采用腹主动脉缩窄法制作心衰大鼠模型。大鼠用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹部手术区备皮、消毒并铺一次性无菌纱布，从剑突下腹正中切开皮肤，切口长约3cm，分层打开腹腔，在肾动脉分支以上5mm处钝性游离腹主动脉，将7号注射器针头平行置于腹主动脉上，用4号手术丝线将腹主动脉和注射器一同结扎，然后缓慢将注射器撤出，关腹，分层缝合，使大鼠腹主动脉直径缩窄为0.7mm。假手术组开腹后将手术丝线穿过腹主动脉，除不缩窄腹主动脉外，其他操作与模型组完全相同。术后常规喂养6w后，开始出现明显心力衰竭症状，如呼吸频率和幅度增加，活动明显减少，饮食减少，毛发干枯无光泽，爪背紫绀，尿少水肿等。造模后大鼠各组分别死亡1、3、2、3、3、3只。于造模成功后，各组大鼠开始灌胃给药，其中假手术组、模型组以蒸馏水10mL/kg灌胃，卡托普利组予卡托普利混悬液7.8mg/kg，参竹心康汤低剂量组、中剂量组、高剂量组分别以参竹心康汤中药煎液11g/kg、22g/kg、44g/kg。以上各药物组再用蒸馏水稀释成等体积10mL/kg灌胃，1次/d，连续给药8w。

1.5心肌组织Smad2测定 实验结束时，于最后一次给药后禁食12h，用3%戊巴比妥钠（45mg/kg）行腹腔注射，大鼠麻醉满意后仰卧固定于手术台，切取左室长轴中点水平约5mm厚的心肌组织，严格按试剂盒说明书进行检测，PBS液清洗，组织剪碎，加入PBS液，制成组织匀浆，置于-20℃冰箱过夜。检测前经2次反复冻融以破坏细胞膜，离心，取上清检测，取出酶标包被板，标准品孔中加入标准品，待测孔中先加入大鼠心肌匀浆上清，然后再加样本稀释液，空白对照孔不加试剂，温育30min，洗板，每个孔中加入酶标工作液，空白对照孔不加，温育30min，洗板，显色，终止，测定，计算。

1.6心肌组织HYP测定 采用碱水解法检测各组大鼠心肌组织中羟脯氨酸的含量，严格按试剂盒说明书进行检测，按上述方法取心肌组织，用手术剪剪碎后放入试管中水解，将各试管用流水冷却，冷却后加入PH调节液，使PH值在6.0～6.8，向各试管中加入蒸馏水至10ml，然后取4ml稀释的水解液，在其中加入30mg活性炭，摇晃试管使混和均匀，放入离心机中，以3500转/min的转速离心10min，若离心后上清液为澄清无色，则说明离心成功，最后小心吸取上清液1.0ml用来检测。受检测玻璃试管置于水浴箱内水浴水解，自然冷却后，以3500转/分的转速离心10min，离心后取上清液，以蒸馏水调零，用分光光度计在550nm处，1cm光径，测定各试管的吸光度。按以下公式计算HYP含量（μg/mg湿重）：（测定管吸光度-空白管吸光度）/（标准管吸光度-空白管吸光度）×标准管含量5μg/ml×水解液总体积（10ml）/组织湿重（mg）。