玉米螟高毒力生防菌株筛选与发酵工艺研究

摘要：以玉米螟（Pyrausta nubilalis）为对象筛选出一株高毒力生防菌株苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）NBIC380。通过培养基优化，获得适宜的培养基配方D。补料发酵研究的结果表明，固定氮源浓度为80 g/L，发酵前期补料效果明显，补料速率为根据发酵不同阶段进行调整，可以取得更好的发酵结果，有利于提高产量，降低生产成本。

关键词：玉米螟（Pyrausta nubilalis）；生防菌株；发酵

中图分类号：S433.4；Q813.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）24-6248-04

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2015.24.039

Abstract： A biocontrol strain Bacillus thuringiensis NBIC380 with high virulence to Pyrausta nubilalis was obtained. According to this strain， appropriate media formulations D was obtained by medium optimization. Fed-batch fermentation experiments showed fermentation pre-feeding effect was obvious by using 80 g/L nitrogen concentration. Feeding rate was adjusted according to the different stages of fermentation. This strategy could improve production and reduce production costs.

Key words： Pyrausta nubilalis； biocontrol strain； fermentation

玉米螟（Pyrausta nubilalis）是世界性害虫[1]，在中国各玉米产区均有发生，使用化学防治带来的农药残留危及食品安全，尤其是随着鲜食玉米消费量的不断上升，使得问题更是突出。20世纪60年代，国内就开始尝试采用Bt制剂拌土或细砂后灌心，或者使用飞机喷雾防治玉米螟低龄幼虫[2，3]。市面上多数Bt制剂产品对玉米螟幼虫都有一定的效果，但没有以玉米螟为靶标进行筛选的专用菌种[4，5]。为此，本研究旨在建立以玉米螟初孵幼虫为靶标的高毒力菌株筛选体系，并开展其工程化技术研究开发[6，7]。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种：Bt菌种1～15号，均由湖北省生物农药工程研究中心自行分离并保存，均可用于Bt产品生产。对照菌株MP-18，由湖北康欣农用药业有限公司提供。

供试虫：玉米螟采自黑龙江省，由湖北省生物农药工程研究中心养虫室保种并培养，提供供试初孵幼虫。

培养基A、B、C、D均为湖北康欣农用药业有限公司筛选优化的Bt生产用培养基。分批发酵培养基：碳源浓度为25 g/L，氮源浓度为55 g/L，pH 6.5～7.0。补料发酵培养基起始碳源浓度 15 g/L，氮源浓度80 g/L，pH 6.5～7.0。

1.2 方法

1.2.1 混菌法 参照国家标准GB/T 19567.1-2004中棉铃虫生物测定方法进行。

1.2.2 分批发酵方法 从斜面上接一环菌入摇瓶种子培养基中，28 ℃，200 r/min下培养至对数期后期，以5%接种量接入400 L种子发酵罐中，装料240 L，罐压0.02 MPa，在发酵过程中通过空气流量及搅拌转速对溶氧进行控制， pH不予控制。镜检观察，种子长到合适的阶段后，压入5 t罐继续发酵培养，待晶体形成并脱落1%～5%，放罐。

1.2.3 补料发酵方法 前期的补料发酵在500 mL三角瓶中进行。小试在20 L不锈钢自动发酵罐中进行补料发酵。中试在生产车间5 000 L发酵罐中进行补料发酵。小试发酵过程中各种数据电脑监控记录， pH、溶氧由pH电极和溶氧电极在线检测，搅拌转速在100～500 r/min内无级调速，投料体积12 L；培养基121 ℃灭菌30 min，通气量2 m3/h。

摇瓶补料发酵：氮源一次添加，补加碳源为液化淀粉，维持总碳源浓度为30 g/L，发酵12 h补加剩余碳源，培养至孢晶20%分离时下摇床。

20 L及5 000 L发酵罐补料发酵：根据pH变化确定补料时机，当淀粉液化完成、pH即将回升、有机酸等中间代谢积累物开始快速被利用时，开始补料。此时细胞对氧的需求加大，生长速度加快。补料开始时，降低培养温度，由起始31 ℃降为28 ℃培养，降低生长速率，缓解菌体急剧生长时供氧与需氧的矛盾，延长对数期；根据溶氧确定转速的调控，起始转速为300 r/min，当溶氧急剧下降时，将转速调为500 r/min；根据还原糖浓度确定补料速度，采用蠕动泵自动控制，补料开始时菌体量较小，补料周期为30 s泵1 s，当糖的利用速率大于补糖速率时，逐步提高补料速率，补料周期最高调至10 s泵1 s，当还原糖含量开始积累时，停止补料，此时生长速率减缓，第14 h停止补料。后期补料将会导致营养物残留过多，芽孢形成率过低。小试利用蠕动泵控制补料速率，中试通过400 L罐阀门的开合大小控制补料速率。

1.2.4 分析方法 pH和溶氧利用梅特勒电极在线测定；发酵液中还原糖采用艾科精仪血糖仪测定；含固量采用冷冻干燥法测定；毒力测定以玉米螟二龄幼虫、棉铃虫初孵幼虫为试虫，采用人工饲料混合法测定Bt发酵培养物的LC50；伴孢晶体蛋白含量采用SDS-PAGE法进行测定。

2 结果与分析

2.1 高毒力菌株筛选

以玉米螟初孵幼虫为试虫，对15株保存的高毒力Bt菌株的摇瓶发酵培养物进行了毒力测定，结果见表1。综合3次生测结果，选取毒力相对较高的1号、6号和8号菌株进行下一轮菌种筛选和培养基的优化。

2.2 发酵培养基的筛选

选取第一轮筛选出的毒力较高的1号（NBIC-487）、6号（NBIC-380）、8号（NBIC-1586）3个菌株，采用已有的A、B、C、D 4种Bt发酵配方，分别进行摇瓶发酵，取发酵液进行玉米螟二龄幼虫的生物测定，以下是3次重复生测的结果。

结果表明，BtNBIC-380菌株在4种配方上的表现均优于其他菌株，BtNBIC-380和BtNBIC-1586菌株在D配方上的表现均优于其他3种配方，它们的杀虫毒力均为现有生产菌株的9～10倍，故以Bt NBIC-380菌株、D配方进入下一步研究。

2.3 摇瓶补料发酵

2.3.1 不同初始碳源浓度对摇瓶补料分批发酵和毒力的影响 氮源一次添加，补加碳源为液化淀粉，维持总碳源浓度为30 g/L，发酵12 h时补加剩余碳源，培养至孢晶20%分离时下摇床，取适量进行棉铃虫的生物测定和晶体蛋白含量测定。结果（表2）显示，摇瓶发酵同步率为95%，生物测定效价为5 344 IU/μL，晶体蛋白含量为4.0 mg/mL。

2.3.2 不同补加碳源方式对摇瓶补料分批发酵和毒力的影响 初始碳源浓度为18 g/L，氮源一次添加，补加碳源为液化淀粉，维持总碳源浓度为30 g/L，分别在发酵不同时间补加剩余碳源，培养至孢晶20%分离时下摇床，取适量进行棉铃虫的生物测定和晶体蛋白含量测定。从表3可以看出，在8 h开始补，分两次补加效果较好，发酵效价略有提高，与对照（CK）比，晶体蛋白含量提高约10%。

2.4 Bt NBIC-380菌株20 L罐分批发酵

Bt NBIC-380高毒力菌株在20 L发酵罐中的分批发酵与其他菌株有很多相似之处（图2），由于糖的代谢，pH的变化呈现双峰，发酵末期pH逐步升高，溶氧（DO）在发酵开始后迅速下降，在14 h左右达最低点。泡沫在早期较多，到一定时间后逐渐消失。根据发酵的特点，在12～22 h将搅拌转速提高到700 r/min，可有效地防止发酵过程中溶氧掉零，保证正常的Bt代谢。

2.5 Bt NBIC-380菌株20 L罐补料发酵工艺研究

2.5.1 氮源浓度为60 g/L的补料发酵 如图3所示，发酵开始5 h后pH止跌缓慢回升，还原糖浓度较低，0.432 g/L时开始补料，补料所用碳源为葡萄糖，浓度为400 g/L，蠕动泵补料周期为30 s泵1 s，补料后还原糖浓度上升，pH下降。7.5 h pH止跌缓慢回升，还原糖浓度停止回升，调整补料周期为20 s泵1 s。10 h因菌体生长迅速，还原糖浓度下降，调整补料周期为10 s泵1 s，14 h还原糖浓度较高，停止补料，共补糖400 g。31 h取样镜检：20%晶体脱落，孢囊形成率90%以上，停止培养，放罐。

2.5.2 氮源浓度为80 g/L的补料发酵 如图4所示，发酵开始5.5 h后pH止跌缓慢回升，还原糖浓度较低，0.432 g/L时开始补料，补料所用碳源为葡萄糖，浓度为600 g/L，蠕动泵补料周期为30 s泵1 s，补料后还原糖浓度上升，pH下降。7.5 h pH止跌缓慢回升，还原糖浓度停止回升，调整补料周期为20 s泵1 s。10.5 h因菌体生长迅速，还原糖浓度下降，调整补料周期为10 s泵1 s，14.5 h还原糖浓度较高，停止补料，共补糖540 g。35 h取样镜检：10%晶体脱落，孢囊形成率90%以上，停止培养，放罐。

对补料发酵得到的培养物的毒力、蛋白含量及含固量等进行了测定，结果见表4。由表4可知，通过补料发酵可提高发酵液的毒力和蛋白含量。以氮源浓度为80 g/L的补料发酵，晶体蛋白含量较分批发酵提高29%，毒力提高36.7%。表明补料发酵在提高Bt发酵水平、降低生产成本具有巨大的潜力。

3 小结与讨论

不同Bt菌株对玉米螟的毒力相差悬殊，Bt NBIC-380菌株为湖北省生物农药工程研究中心当前保存的对玉米螟毒力最高的Bt菌株，具有明显的商业开发价值。

同一菌株，不同培养基，获得的培养物对玉米螟的毒力相差非常明显，这一点与发酵工业中其他产品生产有所不同。因此，在微生物农药研究开发中，一味追求某种单一物质的产量可能会进入误区。

芽孢杆菌发酵周期一般较短，较少采用补料发酵，但补料发酵对芽孢杆菌生产的产品质量提升、单罐效率提高和成本降低同样有重要作用。

参考文献：

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