鳗弧菌载体疫苗保护剂的改善

鳗弧菌（Vibrio　anguillarum）和嗜水气单胞菌（Aeromonas　hydrophila）是世界上海洋、淡水鱼类的重要致病菌［1］，利用疫苗防治具有重要意义。鳗弧菌载体疫苗MVAV6203A－1是在aroC基因缺失减毒株MVAV6203的基础上，转入表达嗜水气单胞菌抗原GapA34的二价载体疫苗。免疫保护试验证实：此菌株能使大菱鲆（Scophthalmus　maxi－mus）对鳗弧菌和嗜水气单胞菌产生很好的免疫力，具有很好的应用前景。但是鳗弧菌耐渗透压和低温能力较差，如何最大限度地保持鳗弧菌载体疫苗制品的存活率成为该疫苗生产过程中控制成本、保证质量的关键。真空冷冻干燥技术是目前最常用的生物制品保藏方 法，而 添 加 冻 干 保 护 剂 可 提 高 细 胞 存 活率［2］。冻干保护剂可分为渗透型和非渗透型2种类型，由于单一保护剂各有优缺点，复合保护剂的作用优于单一保护剂［3］。笔者通过单因素筛选，选出适合鳗弧菌的单一保护剂，随后通过组合使用和响应面分析方法对其配比进行优化。

1　材料与方法

1．1　菌种

鳗弧菌载体疫苗株MVAV6203A－1由本实验　室构建和保藏。

1．2　培养基

种子培养基和发酵培养基均为添加3％ NaCl的LB培养基，培养过程中添加200μg／mL的氨苄青霉素钠（购自上海生工生物工程有限公司）。

1．3　保护剂及其配制

所选用的保护剂分为5类：（1）糖类：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖；（2）多元醇类：甘油、甘露醇、山梨醇、木糖醇；（3）聚合物类：聚乙烯吡咯烷酮、可溶性淀粉；（4）氨基酸类：谷氨酸钠；（5）其他：二甲基亚砜、蛋白胨。以上保护剂分别用蒸馏水配制成高浓度的储备液，按试验设计配制成各种复合保护剂。其中氨基酸类用0．22μm孔径的滤膜过滤除菌，其余于115℃下灭菌15min。

1．4　鳗弧菌的培养和冻干

将菌种以2％的接种量接至活化培养基中进行种子活化，37℃培养12h，接种至发酵培养基进行扩大培养，37℃培养12h。4 ℃，6300r／min离心15min，收集菌体并用无菌PBS（2％ NaCl）洗涤3次，加入制备好的保护剂，将菌体密度调节至1×1010～3×1010cfu／mL。放入－80 ℃超低温冰箱中快速冷冻，然后转入真空冷冻干燥机中干燥24h。

1．5　活菌计数

采用平板计数法，分别测定冻干前、后活菌总数，计算存活率。

1．6　试验设计

1．6．1　单因素试验

将所选用的保护剂分别在5％、10％、15％质量分数下用10％脱脂牛奶配置，进行冻干，观察鳗弧菌冻干粉的冻干程度和外观，测定冻干前、后活菌数，计算存活率。

1．6．2　保护剂的组合试验

将单因素试验中冻干存活率大于40％的保护剂选出，进行C25数学组合试验，观察鳗弧菌冻干粉的冻干程度和外观，测定冻干前后活菌数，计算存活率。

1．6．3　响应面分析

根据中心组合设计原理，对选出的复合保护剂的各因素进行试验设计，通过试验数据拟合得到二阶响应面模型，最终确定最优配方，并进行验证。用Design　Expert　7．0软件（Stat－Ease　Inc．，Min－meapolis，USA）设计试验，分析数据。

2　结果与分析

2．1　单因素试验

菌体在各种保护剂中的冻干存活率结果见表1。其中，质量分数为5％的半乳糖、海藻糖、甘油、甘露醇和木糖醇作为保护剂，存活率较高，其存活率分别为58．4％、54．5％、44．6％、44．2％、53．7％。

2．2　组合使用试验

质量分数为5％的任何2个保护剂用10％的脱脂牛奶配置，所有组合可以分成3类：多元醇＋多元醇、糖＋糖、糖＋多元醇。试验结果见表2。由表2可知，半乳糖和海藻糖的组合使用细胞存活率为67．8％，高于保护剂的单一使用，而其他组合冻干后的存活率均低于单一使用。

2．3　中心组合设计优化设计结果和响应面分析

通过对脱脂牛奶、半乳糖和海藻糖3种成分进行中心组合设计（表3），得到了相应的二次方程模型：y＝67．79－4．97x1－8．64x2＋3．6x3－13．24x21－3．63x22－19．18x23（1）式中，y是响应值，即冻干后的细胞存活率；x1、x2、x3分别表示半乳糖、海藻糖和脱脂牛奶的编码值。二次模型方差分析结果见表4，多元相关系数为r2＝0．9887，说明模型对实际情况拟合较好；P＜0．0001表明该模型显著，可以用来进行响应值预测［4］。多元回归方程所作的响应曲面三维图和等高线图见图1。可以对任何2个因素的交互作用进行分析和评价，以确定最佳因素水平范围。利用Design　Expert　7．0软件优化出的多种配方，综合实际考虑，当4．6％半乳糖＋2．3％海藻糖，10．2％脱脂牛奶作为复合保护剂使用时，能使细胞存活率达到77．3％，与预测值（73．3％）较为接近。说明该优化结果可信程度较高，能够用于保护剂配方的筛选和优化。

3　讨论

细胞中的蛋白质分子存在大量的氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子连接。当细胞在冷冻干燥过程中失去水分后，蛋白质中的氢键被破坏，造成细胞不可逆的损伤。保护剂的加入可以降低细胞受损程度，甚至可以保护细胞不受损害［5］。因此，鳗弧菌的冻干保护剂的筛选很有必要。

冷冻干燥时，半乳糖和海藻糖能渗透至细胞内部，填充在蛋白质等生物大分子周围，干燥失水后，半乳糖和海藻糖的羟基可与生物分子的极性基团形成氢键，代替极性基团周围失去的水分子，使生物分子表面形成一层“水合层”，有效保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，保持了生物分子的天然结构和功能的完整性［6－8］。此外，鳗弧菌对高渗透压比较敏感，添加保护剂，使溶液的黏性增加，弱化了水的结晶程度，减轻了细胞外由于溶质密度升高所造成的细胞损伤。脱脂牛奶本身就是一种复合型的保护剂，含有氨基酸、酪蛋白、维生素、微量元素等多种物质，对细胞适应冷冻干燥环境起到积极的作用［9］，而且添加脱脂牛奶的样品冻干后具有较好的组织结构和复水性［10］。

本试验通过响应面分析法，确定了鳗弧菌载体疫苗MVAV6203A－1冻干保护剂的最佳配比，对该疫苗株的应用、提高活菌产品的质量和新产品的开发、研制均具有一定的指导意义。