时间：2022-05-29 06:42:40
摘要：文章在对NM-01菌株孢子粉的研究中，可湿性粉剂的配方初步确定为：每千克制剂中孢子量为0.1kg，木质素磺酸钠0.1kg，腐植酸0.01kg，硅藻土0.79kg。检测结果表明可湿性粉剂的含孢量可达5.9×108个/g，含水量为2.1%，悬浮率达81.5%，细度95.6%，可过200目筛。本研究主要是通过菌株NM-01孢子生物学相容性的润湿剂、分散剂、紫外保护剂等，将菌株NM-01加工成可湿性粉剂，为该菌的开发应用提供依据。
关键词：可湿性粉剂；孢子；生物农药
中图分类号：TQ450 文献标识码：A 文章编号：1674-1723（2013）03-0223-03
随着人们环保意识的加强，生产无公害食品显得尤为重要。农业生产中，病虫害防治的无公害化则是无公害农产品生产的关键。然而，真菌制剂化是微生物农药应用的先决条件。现有生物制剂大多采用液体形式，但其附着力较差、运输和储存不便、防治效果不稳定。现代生物农药制剂研发，不但保证防治效果稳定，更需要兼顾易储存和方便使用等方面。可湿性粉剂为近年来生物农药制剂研发的一个重要方向，可湿性粉剂具有易用、易储存、易运输等优点。在制备可湿性粉剂过程中所用填充助剂选择不当往往会对真菌孢子的萌发产生影响。因而在真菌制剂不同助剂类型对孢子是否会产生影响，哪种助剂跟有利于制剂效应的发挥，都是值得深入研究的问题。本研究通过对润湿剂、分散剂、紫外保护剂等助剂类型的研究，确定可湿性粉剂的主要成分及含量，从而确定NM-01可湿性制剂的主要成分，为NM-01应用于生产提供理论指导。
一、材料与方法
（一）材料
本研究中所用的主要分散剂为：木质素磺酸钙和木质素磺酸钠由天津试剂有限公司购买。主要紫外保护剂：糊精、抗坏血酸、荧光素钠、海藻酸钠等（购自上海恒大精细化工有限公司）。
所用主要载体为：高岭土、碳酸钙、滑石粉、膨润土、硅酸、硅藻土（购自上海恒大精细化工有限公司）。
（二）实验方法
1.载体对NM-01孢子萌发和生长的影响。测定载体对孢子萌发的影响，参考程立君等的方法并进行改进，将载体与液体真菌培养基混合灭菌后，取150μL添加至无菌96孔板，同时添加50μL浓度为200个孢子/mL的孢子悬浮液，以不含载体的培养基为对照。将96孔板25℃培养5小时后，倒置显微镜观察各平板孢子的萌况计算载体对孢子萌发的影响。同时，制备PDA平板，将孢子悬浮液涂布于平板，测量各菌落的直径，记为D，计算菌落直径增长量：D/生长天数。
2.不同类型分散剂效果比较。分别配制分散剂母液，分别为125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL将分散剂溶液分别与真菌液体培养基混合。添加至96孔板，25℃培养5小时后，倒置显微镜观察各平板孢子的萌况计算载体对孢子萌发的影响。以不含分散剂培养基作为对照。菌落直径的增加实验采用平板法测量。将上述筛选出的较好的分散剂，制备母液90mL，添加10mL孢子悬浮液，摇匀后分别于0h、2h、4h从悬浮液上中下三层取样，计数，考察分散剂对孢子的分散效果。
3.不同类型紫外保护剂效果比较。配制孢子悬浮液，取150μL悬浮液添加至96孔板，并添加紫外保护剂0.3μL，混合均匀。于紫外灯下照射10min后，于25℃下黑暗培养5h。倒置显微镜下计数萌发孢子数并计算出萌发率。以不加紫外保护剂的孢子悬浮液和不照射的作为对照。
4.可湿性粉剂的质量指标。制备可湿性粉剂可过220目标准筛，将样品充分混合后，称取5mg样品，在250三角瓶中充分洗脱，静置10min，取1mL加入9mL孢子萌发液，在显微镜下观测孢子萌发数，计算含孢率：含孢率（%）=发芽孢子数/总孢子数*100。使用120℃烘箱，烘干2h，计算烘干之后的样品变化率既为含水率。悬浮率的测定参考GB/T14825-93，测定其悬浮率。细度参照GB/T16150-1995测定。
二、结果与分析
（一）载体对菌体的影响
由上图可知，载体对孢子的萌发影响差别较大，膨润土对孢子萌发的影响最小，孢子萌发最高可达85个，与对照差异不显著，其次为碳酸，硅藻土。通过上述研究发现，不同载体对菌丝的生长均存在一定的影响，其中，碳酸钙对菌体生长的影响最小，其菌落的日增长量可达15mm/d，其他处理的差异不显著。综合对孢子萌发以及菌丝生长的影响，可以再膨润土、硅藻土之间进行选择。
（二）分散剂对菌体的影响及分散效果
图3 分散剂对孢子萌发的影响
A：木质素磺酸钙； B：木质素磺酸钠
图4 分散剂对孢子萌发的影响
A：木质素磺酸钙； B：木质素磺酸钠
由上图可知，两种分散剂孢子有一定的影响，通过显著性差异分析表明，其抑制作用于对照相比未表现出显著差异。随分散剂浓度的增加，也没表现出明显增强的抑制作用。对菌丝的生长也没有表现出明显的抑制作用，并且与浓度无关。分散剂分散效果比较结果如表1，对比各浓度分散剂分散效果高浓度分散剂分散效果要优于低浓度。两种分散剂相比，木质素磺酸钠的分散能力较好，并且比较稳定，而木质素磺酸钙效果较差，4h后孢子开始聚集。
（三）紫外保护剂的保护作用
图5 紫外保护剂对孢子的保护作用
由上图可知，紫外保护剂荧光素钠和腐植酸保护作用最为明显，在经紫外照射后分别为25cfu和30cfu，与对照（29cfu）无显著差异。其余保护剂保护效果较差，在处理后，没有起到很好的保护作用。研究结果表明，可以选择腐植酸和荧光素钠作为可湿性粉剂的保护剂。
（四）可湿性粉剂的质量检测
由表可知，可湿性粉剂的含孢量可达5.9×108个/g，含水量为2.1%，悬浮率达81.5%，细度95.6%可过200目筛。其质量指标完全达到主要行业标准。
三、结语
本实验研究了可湿性粉剂制备过程的主要步骤及所用到的主要辅料对菌体孢子的影响，通过倒置显微镜法，测定了制剂载体、分散剂和紫外保护剂等多种助剂对菌株NM-01菌落形成单位数、菌丝生长量等的影响。结果显示各载体对孢子萌发影响均不显著，其中膨润土的影响最小，但载体对菌丝生长均表现出了一定的抑制作用，碳酸钙抑制作用最小；两种分散剂对孢子萌发未表现出明显的抑制作用，但对菌丝生长抑制作用发现，木质素磺酸钠对孢子生长影响较小；荧光素钠和腐植酸对孢子紫外保护作用明显，能有效防止紫外线对孢子的损伤，由于荧光素钠具有一定的颜色，所以选择腐植酸作为紫外保护剂。通过本研究确定可湿性粉剂的配方初步确定为：每千克制剂中孢子量为0.1kg，木质素磺酸钠0.1kg，腐植酸0.01kg，硅藻土0.79kg。检测结果表明可湿性粉剂的含孢量可达5.9×108个/g，含水量为2.1%，悬浮率达81.5%，细度95.6%可过200
目筛。
参考文献
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作者简介：张鹏（1983-），男，山东莱西人，青岛科技大学化工学院在职硕士，滨化集团股份有限公司助理经济师，研究方向：生物化工。