脾阴虚证大鼠模型心脏组织MAPK信号转导与调控的研究

李　丹　李德新　崔家鹏　刘 进　朱爱松

摘　要：目的：通过观察脾阴虚证大鼠模型MAPK活性变化，探讨在脾阴虚状态下大鼠心脏组织mapk活性变化规律及其调控机制，进一步揭示脾阴虚证的病理实质和滋脾阴法的作用，从而为脾实质的研究提供客观依据。方法：采用饮食不节、疲劳过度和药物损伤复合造模法塑造脾阴虚证动物模型。采用免疫沉淀法检测心脏组织中MAPK活性。结果：脾阴虚证模型组与正常对照组相比，心脏组织的细胞浆MAPK活性升高(P＜0.05)，脾阴虚证治疗组与正常对照组相比，心脏组织的细胞浆MAPK活性升高(P＜0.01)，与脾阴虚证模型组相比，心脏组织的细胞浆MAPK活性升高(P＜0.01)。结论：脾阴虚证状态下，大鼠心脏组织MAPK参与的细胞信号转导发生改变。滋脾阴方药能有效调控脾阴虚证大鼠心脏组织MAPK活性变化，可能为滋脾阴方药作用机制之一。

关键词：脾阴虚证；MAPK；滋脾阴方药

中图分类号：R33

文献标识码：A 文章编号：1673－7717(2007)07－1385－03

现代科学认为，细胞是生物体结构和功能的基本单位，细胞信号转导是机体内一部分细胞发出信号，另一部分细胞接收信号并将其转变为细胞功能变化的过程，生命现象的发生实际上都是机体内外信号传递的结果。在多条信号通路中，有丝分裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated pro-tein kinase，MAPK)信号转导通路是多种信号转导途径的共同作用部位，在多种信号传递途径中均具有关键性作用。因此探讨脾虚状态下MAPK信号转导通路的变化规律具有重要的意义。本项研究通过观察脾阴虚证大鼠模型MAPK活性变化，探讨在脾阴虚状态下大鼠心脏组织MAPK活性变化规律及其调控机制，进一步揭示脾阴虚证的病理实质和滋脾阴法的作用，从而为脾实质的研究提供客刃已依据。

1 材料与方法

1．1 实验动物分组及造模实验选用3月龄健康SD大白鼠60只(由辽宁中医药大学实验动物中心提供)，雌雄各半，平均体重(195±20)g。随机分为3组：正常对照组、脾阴虚证模型组、脾阴虚证治疗组。实验第1－25天为造模阶段，采用目前公认的复合因素造模方法，即在过劳加饥饱失常方法造成脾气虚证的基础上，造成脾阴虚证动物模型。

1．2 治疗及药物从实验的第26－89天，脾阴虚证模型组停止施加造模因素，对脾阴虚证治疗组给予拟定的滋脾阴方药(一次性购于辽宁中医药大学附属医院)，浓度为每100mL药液含生药100g，每日每只1.55mL/100g体重，胃饲。其他各组每日采用生理盐水3mL/只，胃饲。

1．3 主要试剂及仪器主要试剂：MBP(Sigma公司)，[γ－32P]ATP(北京亚辉生物医学工程公司)，考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，其他为国产分析纯。主要仪器：MR1822型低温高速离心机(法国)，Beckman LS－180液闪仪(USA)。

1．4 标本制备实验第90天，20％乌拉坦腹腔注射麻醉(0.4mL/100g体重)，断头取心脏组织，置于－70℃低温冰箱中保存备检。取0.1g心肌组织，加入0.6mL BufferA粉碎缓冲液(100mL含2mM EDTA，10mM EGTA，20mMTrisHC1 pH7.5，0.25M蔗糖)，剪碎，匀浆，超声粉碎(5s/，次，间隔38，共10次)，4℃15000r/min离心1h，上清液为细胞浆蛋白。

1．5 检测方法(免疫沉淀法)及主要程序 将20μL样品与含MBP(1mfmL)的25μL激酶缓冲液[20mmol/LHEPES，pH7.2，10mmol/L MgCl2，2mmol/L MnCl2，2mmoL/LDTT，0.5mmol/L NaVO4，0.1mg/mL BSA，2mmol/L蛋白激酶抑制剂，2.0μCiγ－32P－ATP(1×106cpm)]，30℃震荡反应15min，取10μL反应液滴在Whatman P81离子交换滤纸上晾干，用75mmol/L磷酸洗3次，每次2min，取出吹干，将滤膜放入含10mL蒸馏水的液闪瓶中，以Beckman闪烁计数仪测定其放射活性。MAPK活性以比活性表示。比活性表示30℃时每mg蛋白质每分钟催化[γ－32P]－ATP掺入底物蛋白的pmol量。

1．6 数据统计处理所有数据用x±s表示。实验结果采用SPSS软件11.0版本进行处理。

2 结　果

脾阴虚证大鼠心脏组织的MAPK活性变化(见表1)。方差分析结果表明，脾阴虚证大鼠心脏组织的细胞浆MAPK活性变化有统计学意义。脾阴虚证模型组心脏组织的细胞浆MAPK活性升高明显，滋脾阴方药能显著升高脾阴虚证治疗组大鼠心脏组织的细胞浆MAPK活性，并使其显著高于正常水平。

3　讨　论

细胞信号传递系统是一个复杂的调控网络。细胞间通讯及细胞内信息的传递是机体实现自我调节及多种生命过程的重要方式。在众多的信号转导通路中，MAPK是接收膜受体转换与传递的信号并将其带入细胞核内的一类重要分子，在多种受体信号传递途径中均具有关键性作用。MAPK是细胞增殖与分化信号转导的共同通路，是血管平滑肌和心肌细胞中多种信号向核内传递的共同途径，在血管平滑肌增殖和心肌肥大中起重要作用，在动脉损伤后异常表达，与平滑肌细胞迁移、新生内膜形成、血管重塑及心肌梗死后心肌重塑有关。在缺氧环境下，MAPK的激活对心肌细胞起保护作用，阻断MAPK的激活可造成心肌细胞损伤加重，可见MAPK转导途径在心脏的生理病理过程中起着重要的作用。在本研究中，脾阴虚状态下，大鼠心脏组织的MAPK活性发生变化，由此推测MAPK在脾阴虚证病理过程中发生变化的可能机制包括如下几种。

①参与蛋白酪氨酸激酶(PTK)、蛋白激酶C(PKC)的信号转导：PTK和PKC是MAPK通路的上游激酶。关崇芬等通过脾虚动物实验及脾虚患者的临床检测结果显示：脾虚证淋巴细胞内蛋白酪氨酸激酶活力低下。另有研究表明大鼠胃黏膜损伤后蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性增高，其信号转导主要经MAPK通路。本课题组以往研究表明脾阴虚证大鼠PKC活性发生变化。因此，脾阴虚证病理状态下MAPK通路的改变可能与PTK和PKC活性的改变有关。

②参与脾阴虚证胃肠激素和某些细胞因子等细胞信号的传递：许多胃肠激素包括胃泌素、生长抑素、P物质、血管活性肠肽、缩胆囊素、胃动素、神经降压素、三叶肽等均被证实与脾虚状态下胃肠异常运动及消化功能异常密切相关。其作用机制与MAPK有关。刘秀华发现生长抑素抑制内皮素刺激的平滑肌细胞增殖与其抑制MAPK的活性有关。某些血管活性肽和生长因子可以激活MAPK。胆囊收缩素对免疫功能的调节也与MAPK通路有关。因此，脾阴虚证病理状态下MAPK通路的改变可能与某些参与脾虚证病理改变的胃肠激素的信号转导有关。

③参与脾阴虚状态下的免疫调节机制异常的信号转导途径：现代研究表明，脾与细胞免疫、体液免疫、红细胞免疫、局部免疫、免疫遗传和细胞因子活性均有密切的关系。林氏发现在细菌脂多糖在对巨噬细胞的免疫调变过程中MAPK通路的改变是其作用机制之一。魏彦明发现脾虚大鼠产生IL－2、IL－6和TNF等细胞因子能力下降，使免疫功能处于低下状态，四君子汤治疗能够提高脾虚大鼠产生细胞因子的能力，从而达到健脾益气以调整机体免疫的作。

④参与脾阴虚证活性氧信号的转导过程：研究资料表明脾阴虚证时，机体抗氧化能力降低，抗氧化酶活性下降，积累过剩的氧自由基，破坏生物膜的结构和功能，从而造成机体组织和脏器的损伤。而Cotoh等报道MAPK体系具有拮抗氧自由基，减轻脂质过氧化的作用。

关于中药对MAPK信号转导途径的作用方面的研究较少。陆梁在实验中证明中药红花黄色素对血管平滑肌细胞的增殖有抑制作用，可能是通过抑制PKC依赖的MAPK信号转导途径而发挥作用的。聂亚雄在研究中药方剂脑溢安治疗脑出血疗效机制时，发现其对MAPK信号转导通路起着双重的调节作用，并认为这为中药治疗脑出血疗效机理找到了的新的亮点。管冬元在研究不同治疗方法对实验性肝癌的作用机理时，发现不同治法能够针对性地调节癌基因ras/MAPK信号转导通路上一些不同信号分子的转录水平 。

本实验中发现，脾阴虚证大鼠心脏组织的细胞浆MAPK活性发生变化，滋脾阴方药能明显升高脾阴虚证模型组大鼠心脏组织的细胞浆MAPK活性，并使其显著性高于正常水平。本课题组以前的研究表明，本次实验所使用的滋脾阴方药具有很好的抗氧化能力，可以降低过氧化脂质含量，同时提高抗氧化酶的活性。因此推测本滋脾阴方药可能是通过MAPK信号转导途径来调控活性氧信号的转导，进而达到减轻脾阴虚证中自由基氧化损伤的治疗效果。其具体转导路径，有待进一步研究。