在神经胶质细胞瘤中Smad4的研究进展

摘要：神经胶质细胞瘤是最常见的肿瘤之一，它的发生率和死亡率均占全部恶性肿瘤的前列。大肠癌的发生、发展除与外在环境等因素相关外，更主要的与人体内各种肿瘤基因的激活和肿瘤抑制基因的失活、突变和缺失密切相关。Smad4是一种新近发现的抑癌基因，是TGF-β信号转导通路中起瓶颈作用的关键因子。其突变或缺失可使细胞对TGF-β介导的生长抑制效应失去反应，与人类多种肿瘤的发生发展有关。

关键词：Smad4；预后

神经胶质细胞瘤的发生、发展是一个涉及多种基因改变和多阶段致癌的复杂过程。其发生、发展除与外在环境等因素相关外 ，更主要的与人体内各种肿瘤基因的激活和肿瘤抑制基因的失活、突变和缺失，癌细胞的克隆扩增，肿瘤发生时细胞的多样性，及癌细胞的移动导致的浸润和转移等密切相关。各种因素在大肠癌发生发展的各个阶段相互协调，相互作用，共同调控其发生发展。

Smad4基因是一种肿瘤抑制基因，其编码的Smad4蛋白的主要作用是参与TGF-β超家族的信号在细胞内的传导，Smad4是信号传递蛋白Smads的功能活动中心。大多数的生物学效应均是Smad4与不同的Smads蛋白相互作用的结果。TGF-β是细胞对促有丝分裂反应的抑制物，可调节细胞的增殖、分化和凋亡，在组织的发育、再生修复中起重要作用。由于Smad4基因的缺失，使细胞缺乏TGF-β诱导生长抑制作用，进而使细胞疯狂生长而形成肿瘤。Hahn SA等发现在神经胶质细胞瘤中有17%的Smad4蛋白表达缺失。Schutte M等检测也得到一致的结果。Smad4蛋白表达减少的原因可能与Smad4基因的变异有关。Smad4基因的变异可概括为以下三种情况：①染色体片段的丢失包括杂合性缺失或纯合性缺失。②基因突变，如移码突变、无义突变、错义突变等。③基因表达水平异常，即表达水平低下或缺乏。Salovaara等认为Smad4表达的缺失是神经胶质细胞瘤发生的重要因素。SMAD4的缺失或突变失活与恶性肿瘤细胞丧失对TGF-β的反应性而逃避TGF-β的生长抑制作用密切相关，也有文献报道SMAD4基因的突变与结肠癌的恶性演进，如远处转移有关，Smad4表达的缺失可能有利于结肠癌的浸润和转移。Lrmgard等研究发现SMAD4能抑制胰腺癌细胞株HS766T生长，并降低VFGF的表达，抑制血管生成。Irmgardsw等在研究胰腺癌细胞株时发现，在体内Smad4的重新表达抑制了肿瘤的生长，更为重要的是抑制了血管的形成，减少了VEGF而增加了TSP-1的表达。新近有研究认为SMAD4能够体内肿瘤的形成和生长，然而对体外细胞的生长并不受影响，并且不能恢复TGF-β的生长抑制效应，并认为逃逸TGF-β的生长抑制效应和Smad4的表达缺失是肿瘤的发病过程中的相对独立的连续事件，可能是因为体外肿瘤细胞无血管供应，而SMAD4可能是通过对体内肿瘤血管生成的影响而发挥抑瘤作用。文献报道VFGF启动子含有一些潜在的Smad结合序列，在5’端非编码区-1225处含有两个重叠的GAGA盒的Smad4结合元件（SBE）相关序列，在邻近启动子区域含有FAST2/DPC4结合Goosesoid启动子元件密切相关的GC富含序列。事实上VEGF启动子含有Smad4结合原件相关序列，因而SMAD4也具备调节VEGF的理论基础。

1 Smad4基因的发现

Hahn SA等在研究人类胰腺癌标本时，发现90%的胰腺癌显示第18条染色体长臂有等位基因缺失，他们认为18q上发生缺失的区域相当大，足够包括若干个基因，所以DCC（Deleted in colon cancer）基因之外还可能有其它基因。为了鉴定胰腺癌基因，Hahn SA等从寻找杂合性缺失（Loss of Heterozygosity，LOH）入手，利用微卫星标志、YAC、P1-PAC和粘粒序列标志技术，构建了18q缺失图谱和一个近2Mb的物理图谱。该两个图谱揭示，在30%胰腺癌中表现纯合子缺失的位点不包括DCC基因。随后Hahn SA[1]小组用粘粒C917-46和外显子扩增以及cDNA 5`RACE等技术，最终鉴定出一个包含51bp特异顺序的位于开放读码框的表达序列，这一序列从人胚胎cDNA库中确定出19个克隆，它们的排列揭示了一个先前未报道的基因，因其首先在胰腺癌种发现有缺失，而被命名为胰腺癌缺失基因DPC4（deleted in pancreatic carcinoma，locus4）[2]。最终把该基因定位于18q21.1，DCC基因着丝粒旁侧。后来进一步的研究表明，其基因产物的氨基酸序列与黑腹果蝇（Drossphila）的MAD基因的产物Mad蛋白以及秀丽新小杆线虫（Caenorhabditis elegans）的Mad蛋白同源物sma-2，sma-3，and sma-4蛋白具有高度的相似性[3]。DPC4是人类sma-4的同源物，所以DPC4一般也称为Smad4。

2 Smad4基因的结构、表达产物及功能

Smad4基因由2680个碱基组成，包含11个外显子和10个内含子；其cDNA全长1656bp，编码552个氨基酸残基。其核苷酸序列保存在GenBank的U44378中。Smad4基因序列与果蝇Mad基因、Mad同源基因Sma-2、3、4相似。相似性最大（高达85%）的是DPC4的1、2、11外显子，外显子8、9、10的相似性较小（75%）。

Smad4基因的表达产物是Smad4蛋白，属于Smads蛋白家族[4]。Smads蛋白家族是属于TGF-β超家族的亚家族，是目前发现的TGF-β唯一的作用底物，是把TGF-β受体的信号从细胞质传导到细胞核中的中介分子。Smad4蛋白由保守的N端MAD同源区（Mad homology 1 domains，MH1）和C端同源区（Mad homology 2 domains，MH2）及富含脯氨酸的连接区组成。由于MH2区缺乏TGF-β受体的磷酸化位点使其有别于其他Smads分子。MH2区对于Smad4与其他Smads分子形成寡聚体以及Smad4的调节转录功能十分重要，整个MH2区缺失的Smad4突变体仍具有激活转录的功能；MH1区则是Smad4与其它转录因子相互作用并结合特异性DNA序列的关键区域，并通过连接区制约MH2区的活性；在Smad4的连接区存在一个由48个氨基酸组成的富含脯氨酸的调控元件，称为Smad4激活区（Smad4 activation domain，SAD）。SAD的缺乏使Smad4丧失了转录激活活性，但不影响Smad4与其它Smads分子或转录因子形成复合物。同时，SAD激活需要转录子P300的参与[5]，Smad核作用蛋白1（Smad nuclear interacting protein，SNIP1）过表达则可抑制Smad4/P300复合物的形成[6]。Smad4是TGF-β信号转导通路的必须因子，在各种Smads蛋白的相互作用中，Smad4可能是中心环节，其在TGF-β受体传导途径中具有独特且不可替代的作用。

3 Smad4的下游目的基因

Smad4作为一种肿瘤抑制基因，其功能的失活可能参与了肿瘤的侵袭和转移，但具体有哪些下游基因受Smad4蛋白的调控仍不很清楚。Grau等[7]研究了5例胰腺癌细胞株，结果表明：TGF-β介导p21waf1的诱导和生长抑制需要Smad4的表达，认为p21waf1是Smad4的下游目的基因。Schwarte-Waldhoff等[8]在Smad4缺陷的SW480.7结肠癌细胞株中重建Smad4的表达，发现SW480.7结肠癌细胞株重新获得了抑制肿瘤形成的能力，此外，Smad4转染的细胞形态发生变化，其粘附和扩散加快了，进一步研究发现这种表现型的改变与尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinase-type plasminogen activator，uPA）和纤溶酶原激活剂抑制因子-1（plasminogen-activator-inhibitor-1，PAI-1）的表达水平下降有关。所以Smad4在调控细胞的粘附和浸润方面可能发生重要作用，uPA和PAI-1可能是Smad4的下游目的基因。Schwarte-Waldhoff等[9]在研究胰腺癌细胞株时发现，在体内Smad4的重新表达抑制了肿瘤的形成，更重要的是抑制了血管的形成，减少了血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达而增加了血管形成抑制子血小板反应蛋白-1（TSP-1）的表达。Smad4抑制血管的形成可能是Smad4抑制肿瘤发生进展的另一机制，VEGF和TSP-1可能是Smad4的下游目的基因。

4 Smad4功能失活及与肿瘤形成的关系

Smad4的功能失活的主要原因是基因突变和缺失。近期的研究发现，其突变更多地局限于胰腺癌、结肠癌及胆道肿瘤，在胃癌、卵巢癌、肝癌等部位的突变率

Smad4缺失亦是其功能失活的重要原因。研究表明，Smad4基因是18q杂合性缺失的靶基因之一。Smad4的LOH常发生于肿瘤的进展期；在肿瘤细胞获得浸润和转移潜能时，其LOH的频率明显增加；同时伴有Smad4和APC基因LOH的肠息肉形成的肿瘤比仅有APC异常的肠息肉形成的肿瘤恶性程度更高，结果均提示Smad4缺失促进了肿瘤的发展。

然而，Smad4基因突变或缺失并不是其功能失活的唯一原因。最近报道，Smad4的MH1区突变并不影响其本身的活性，但突变型Smad4比野生型更容易被激活的泛素连接酶（ubiquitin ligase）降解，提示通过激活泛素连接酶通路诱导突变型Smad4的降解可能是肿瘤形成和发展的机制之一；尽管结肠癌细胞株SW480.7含有一个野生型Smad4等位基因，由于其编码的蛋白不能表达，使癌细胞仍表现出抗TGF-β效应。关于这种缺失性表达的机制尚不清楚，但至少反映了Smad4的功能静止亦参与了Smad4的功能性失活。

5 展望

综上所述，目前已经作了一些关于Smad4基因与神经胶质细胞瘤发病机制关系的研究，而检测Smad4基因指导临床诊断方面的工作还开展的很少，利用其对肿瘤进行治疗则研究的更少。这些也许是下一步研究的方向。通过Smad4来增强或恢复TGF-β信号转导途径，将对临床上肿瘤的治疗提供新的方法。根据基因作用机理，可以用野生型Smad4取代突变型Smad4或补偿其缺失基因；亦可用反义技术抑制突变Smad4的表达，还可针对Smad4表达的蛋白产物，用药物恢复Smad4（TGF-β）的抑制效应。此外，有学者认为野生型Smad4的过度表达可能避开TGF-β受体的激活而重建一条对细胞增殖产生负调控的新途径，为肿瘤的治疗提供了一些新的思路。

参考文献

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[6] Kim RH，Wang D，Tsang M， et al.A novel smad nuclear interacting protein，SNIP1，suppresses p300-dependent TGF-beta signal transduction[J].Gene Dev，2009，14：1605-1616.

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[8] Schwarte-Waldhoff I，Klein S，Blass-Kampmann S，et al.DPC4/SMAD4 mediated tumor suppression colon carcinoma cells is associated with reduced urokinase expression [J].Oncogene，2012，18（20）：3152.

[9] Schwarte-Waldhoff I，Volpert OV，Bouck NP，et al.Smad4/DPC4-mediated tumor suppression through suppression of angiogenesis[J].2009，97（17）：9624-9629.