藤本豆秸秆发酵生产乙醇的工艺研究

【摘 要】目的：研究藤本豆秸秆被稀硫酸预处理后，经纤维素酶转化，并利用混合菌发酵生产乙醇的工艺条件。方法：以吉林省九台市郊当年产藤本豆秸秆为研究对象，用1.0 %的稀硫酸预处理，用里氏木霉生产纤维素酶，在纤维素酶、热带假丝酵母、酿酒酵母共同作用下采用同步糖化共发酵法生产乙醇。结果纤维素酶生产的最适条件为：藤本豆秸秆由稀硫酸处理后，滤渣中添加适量营养，接入1.5×107～2.0×107个/g底物Trichoderma reeseiTJK108孢子悬浮液，于30℃固态培养7d。最适发酵条件为：发酵温度30℃，发酵周期72h，转速120r/min，纤维素酶用量40IU/g（对底物），热带假丝酵母与酿酒酵母的接种比2：1，酵母菌接种量为10%。在最适发酵条件下，乙醇产率为0.30g/g（乙醇/藤本豆秸秆），比其他试验组产率都高。结论：藤本豆秸秆是价廉易得和来源丰富的可再生资源和能源，被纤维素酶转化后可以生产乙醇部分替代石油。

【关键词】藤本豆秸秆；纤维素酶；热带假丝酵母；酿酒酵母；乙醇

一、材料与方法

1.材料。藤本豆秸秆，取自吉林省九台市郊，当年产。菌种：纤维素酶产生菌（Trichoderma reesei TJK108）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae SQY-002），由吉林工程技术师范学院食品工程学院实验室保存。热带假丝酵母（Candida tropi

calis），购于中国菌种保藏中心。液体种子培养基：YEPD培养基。发酵培养基：取一定量预处理后的藤本豆秸秆，冷却后用30%的NH4HCO3调节pH=4.8，并于121℃下湿热灭菌20min。

2.藤本豆秸秆生产乙醇的总工艺流程（图1）。（1）藤本豆秸秆的预处理。采用稀硫酸预处理玉米秸秆，将玉米秸秆风干后磨碎，于75℃烘箱中烘一昼夜至水分含量恒定，与1.0 %的稀硫酸按一定比例混合（固液比为1：10），121℃下蒸煮120min。（2）纤维素酶的生产―Trichoderma reesei TJK108的固态培养。采用固态发酵工艺。取预处理后的藤本豆秸秆，过滤，滤渣用水和丙酮洗至pH 值呈中性，其主要成分为纤维素。添加0.2%KH2PO4，0.2%MgSO4・7H2O，3%（NH4）2SO4，0.2%吐温-80，10%酒糟，调节pH值至4.8，含水量至70%，121℃灭菌60min，接入1.5×107～2.0×107个/g底物Trichoderma reesei TJK108 孢子悬浮液，于30℃培养，发酵7d。

（3）菌种活化与稀释。从试管斜面上分别取热带假丝酵母和酿酒酵母，在YEPD液体培养基中活化（150r/min，30℃，18h）血球计数板计数，并稀释至108个细胞/ml。（4）酵。向发酵培养基中添加适量的纤维素酶，按10%（体积比，下同）的接种量接入一定比例的热带假丝酵母和酿酒酵母，根据影响发酵的条件进行发酵试验，并选取乙醇产率（乙醇/藤本豆秸秆，g/g）作为测试指标。一是最佳温度的确定。藤本豆秸秆在不同温度下进行发酵（发酵周期为72h，转速为120r/min，纤维素酶用量为40IU/g对底物，热带假丝酵母与酿酒酵母的接种比2：1，酵母菌接种量为10%），分别测定乙醇产率，确定发酵的最佳温度。二是最佳时间的确定。藤本豆秸秆在不同时间下进行发酵（发酵温度为30℃，转速为120r/min，纤维素酶用量为40IU/g对底物，热带假丝酵母与酿酒酵母的接种比2：1，酵母菌接种量为10%），分别测定乙醇产率，确定发酵的最佳时间。三是最佳转速的确定。藤本豆秸秆在不同转速下进行发酵（发酵温度为30℃，发酵周期为72h，纤维素酶用量为40IU/g对底物，热带假丝酵母与酿酒酵母的接种比2：1，酵母菌接种量为10 %），分别测定乙醇产率，确定发酵的最佳转速。四是最佳纤维素酶用量的确定。藤本豆秸秆在不同纤维素酶用量下进行发酵（发酵温度为30℃，发酵周期为72 h，转速为120r/min，热带假丝酵母与酿酒酵母的接种比2：1，酵母菌接种量为10%），分别测定乙醇产率，确定发酵的最佳纤维素酶用量。五是最佳酵母菌接种量的确定。藤本豆秸秆在不同酵母菌接种量下进行发酵（发酵温度为30℃，发酵周期为72h，转速为120r/min，纤维素酶用量为40I

U/g对底物，热带假丝酵母与酿酒酵母的接种比2：1），分别测定乙醇产率，确定发酵的最佳酵母菌接种量。六是最佳酵母菌接种比例的确定。藤本豆秸秆在不同酵母菌接种比例下进行发酵（发酵温度为30℃，发酵周期为72h，转速为120r/min，纤维素酶用量为40IU/g对底物，酵母菌接种量为10%），分别测定乙醇产率，确定发酵的最佳酵母菌接种比例。（5）蒸馏。取100g发酵样，加入200ml蒸馏水，缓慢蒸馏出100ml馏出液。

3.乙醇含量测定。采用气相色谱法。

二、结果与分析

（一）稀硫酸预处理藤本豆秸秆的结果

采用稀硫酸预处理藤本豆秸秆，在主要成分中，半纤维素是第一个参与反应的，木聚糖部分解聚和溶解，然后水解成木糖（反应1），外源硫酸的存在对于木糖单体的形成尤为重要，若缺乏外源酸，就会形成木糖低聚物。该过程中，只有少量的纤维素发生水解反应生成葡萄糖，而木质素经历了解聚作用，但在水或酸中维持不溶解状态。稀硫酸处理后，溶液中主要是半纤维素分解得到的木糖等五碳糖，粉状固体中主要含有已分离开的纤维素和木质素。正常条件下，纤维素的水解需要十分苛刻的条件，但是经稀硫酸处理，半纤维素水解、纤维素和木质素分离开后，可以大大增加纤维素的水解性，这时加入纤维素酶，纤维素酶先吸附到纤维素表面，然后其中的内切酶在葡聚糖链的随机位点水解底物产生寡聚糖，外切酶从葡聚糖链的还原或非还原端进行水解产生纤维二糖，β-葡萄糖苷酶水解纤维素二糖为葡萄糖。这3类酶“协同作用”最终将纤维素降解为葡萄糖（反应2）。反应1（木聚糖的解聚反应）：（C5H8O4）n+H2O（C5H8O4）（n-1）+C5H10O5，反应2（在纤维素酶的作用下纤维素降解生成葡萄糖的反应）：（C6H12O6）nnC6H12O6。

（二）纤维素酶的生产情况

在Trichoderma reesei TJK108的固态培养期间，每天测定1次酶活力。酶活力随时间的变化见表1。固态培养过程中各主要影响因素的变化见表2。由表1可知，发酵前期（0～2d），由于孢子要萌发成菌丝，故纤维素酶生成较慢，酶活较低；发酵中期（2～7d），孢子已完全萌发成菌丝，菌丝代谢旺盛，纤维素酶大量生成，酶活增长较快，酶活力在第7天时达到最高，为

333.4U/g底物；第8 天以后再延长发酵时间，菌体老化，纤维素酶活力增长缓慢，呈下降趋势。可见，纤维素酶产生菌（Tricho

derma reesei TJK108）的固态培养时间以7d为最佳。

表1 酶活力随时间的变化

由表2可知，发酵第1天，纤维素、还原糖和培养基中的营养被消耗，菌体开始生长；2～4 d，当菌体消耗30%左右还原糖后，其生长开始进入旺盛期，该阶段为纤维素的主要消耗期，纤维素消耗了36%左右；4 d 后，纤维素的消耗开始减缓。产酶培养基初始pH值为4.8；0～2d，由于铵根离子被消耗，pH值迅速下降；2～4d，由于培养基中无机盐金属离子的缓冲作用，pH值基本维持在4.0左右；随着纤维素酶的大量合成，到产酶末期，pH值迅速上升。纤维素酶主要是胞外酶。这表明随着纤维素酶的合成，胞外蛋白质随即开始形成。

（三）发酵温度对乙醇产率的影响

由于藤本豆秸秆中含有47.2%的纤维素及20.6%的半纤维素，稀硫酸预处理藤本豆秸秆过程中半纤维素被水解成戊糖，主要为木糖，预处理纤维素再经纤维素酶酶解成纤维二糖继而在葡萄糖苷酶的作用下生成葡萄糖。若温度较低，纤维素酶解速率较低，且乙醇发酵过程中所需要的各种酶酶活较低，影响乙醇产率；温度过高，发酵过程中所需要的一些酶会因此失活，也影响乙醇产率。该试验采用混合菌种发酵使藤本豆秸秆水解成的葡萄糖及木糖均能发酵成乙醇。试验中所采用的热带假丝酵母与酿酒酵母最适发酵温度分别为30℃与31℃。有研究发现，当发酵温度为32℃时乙醇产率较高。

（四）发酵时间对乙醇产率的影响

乙醇发酵需要一个合理的发酵周期，发酵时间的长短直接影响着乙醇产率的高低。在发酵前12h内，乙醇产率变化很小；从12h开始，乙醇产率迅速增加；当达到72h左右时，乙醇产率达到最大值；发酵72h以后，乙醇产率开始降低。分析造成这种现象的原因：在发酵初期，酵母以发酵醪中的糖分为碳源，酵母不断代谢糖分发酵成乙醇；发酵一段时间后，发酵醪中的糖分含量减少，酵母可能开始利用自身的代谢产物乙醇为碳源来维持自身的生长和繁殖。所以，在利用该菌株生产乙醇过程中，应该尽量控制好发酵时间，当发酵达到72h时，就可终止发酵。

（五）转速对乙醇产率的影响

纤维素酶解需要与底物充分接触；一定的转速能保证纤维素底物与纤维素酶充分接触；此外，由于菌株热带假丝酵母一般在“限氧”条件下发酵，这是由酵母本身的代谢方式所决定的。酵母对木糖的代谢分别依赖于：木糖还原酶将木糖转化为木糖醇；木糖醇脱氢酶将木糖醇转化为木酮糖；木糖激酶将木酮糖转化为5-磷酸木酮糖，后者再经3-磷酸甘油醛进入糖酵解途径，在木糖醇转化成木糖酮的过程中，需要有氧的参与。一定的转速可提供该酵母发酵所需要的溶解氧，转速过高，可能会使发酵生成的一部分乙醇挥发掉，而且转速过高，发酵液中的溶解氧增加，还可能导致生成的乙醇氧化成醋酸等其他产物。该试验的适宜转速约为120r/min。

（六）纤维素酶用量对乙醇产率的影响

预处理的藤本豆秸秆经纤维素酶酶解成葡萄糖及纤维二糖，纤维素酶的用量直接决定着预处理玉米秸秆纤维素的最终水解情况及乙醇产率。纤维素酶最适作用条件为温度50℃，pH=4.8，纤维素酶最适用量25IU/g。乙醇产率随着纤维素酶量的增加而增加，当酶活力达到45IU/g时，乙醇产率最高。分析原因可能是50℃时，温度太高，不适于酵母的生长代谢所致。因此，该试验中发酵温度较低为30℃。这个温度对于纤维素酶解所需最适温度要低，会使纤维素酶解速率降低，所以纤维素酶的用量要高一些，以提高纤维素酶解速率，最优量为45IU/g。尽管45IU/g是最优的酶量，但是使用如此高活力的纤维素酶，在经济上是不合算的。当纤维素酶活力从40IU/g增加到45IU/g时，乙醇产率增加甚微。因此，选用40IU/g纤维素酶浓度较为合适。

（七）酵母菌接种量对乙醇产率的影响

酵母菌接种量对乙醇产率有一定的影响，接种量过低，菌体产生的生物量较少，发酵过程不充分，乙醇产率较低；接种量过高，增加了细胞的维持能需要，乙醇产率也无法积累到较高水平。接种量在10%时，乙醇产率最高。

（八）酵母菌接种比例对乙醇产率的影响

采用混合菌种发酵生产乙醇，2种菌的比例对乙醇产率有着一定的影响，热带假丝酵母既能发酵葡萄糖又能发酵木糖生产乙醇，但其发酵葡萄糖产乙醇能力较差，发酵木糖产乙醇能力较强，而酿酒酵母一般不能发酵木糖，但它能快速有效地发酵葡萄糖生产乙醇。采用混合菌种发酵就很好地解决了预处理藤本豆秸秆酶解生产乙醇的技术问题，同时由于纤维素酶解藤本豆秸秆是一个复杂的酶解过程，而预处理藤本豆秸秆水解液中木糖的含量很高，所以采用混合菌种发酵时具有较强发酵木糖能力的热带假丝酵母比例要高一些。热带假丝酵母与酿酒酵母的接种比为2：1时，乙醇产率最高。

三、结论

植物纤维资源是地球上分布最广、含量最大、品种最多、价格低廉且可再生时间短的有机资源之一，利用可再生的植物纤维资源生产燃料乙醇对于缓解能源危机具有重大意义。该试验得到的纤维素酶生产的最适条件是：藤本豆秸秆由稀硫酸处理后，滤渣中添加适量营养，接入15×107～2.0×107个/g底物Trichoderma reesei TJK108孢子悬浮液，于30℃固态培养7d。发酵的最适条件为：发酵温度31℃，发酵周期72h，转速120r/min，纤维素酶用量40IU/g对底物，热带假丝酵母与酿酒酵母的接种比2：1，酵母菌接种量10%，在该条件下乙醇产率最高为0.30g/g。藤本豆秸秆生产乙醇是利用再生资源解决液体燃料的一个国际性大问题，不少国家已在多年以前就开展该项工作。但目前还没有实现大规模工业化生产，主要是经济方面的问题。因此，今后应开发预处理新技术，培育价廉高活力的新型纤维素酶及五碳糖和六碳糖同步发酵的新菌种，研发出流程短、效率高和能耗低的玉米秸秆生产乙醇新工艺，从而降低乙醇生产成本，这将是今后科研的主攻方向。

参 考 文 献

[1]郑鸿雁，昌友权，孙秀娥等.多年生藤本豆蛋白对小鼠免疫功能的影响[J].食品科学.2007，28（9）：526～528

[2].吴润娇，昌友权，任保国等.多年生藤本豆多肽保健功能的研究[J].食品科学.2006，27（12）：733～734

[3]孙秀娥，昌友权，吴润娇等.多年生藤本豆多糖对小鼠免疫功能的影响[J].食品科学.2006，27（12）：739～741

[4]蒋挺大.木质素[M].北京：化学工业出版社，2001

[5]苏茂尧，张力田.纤维素的酶水解糖化[J].纤维素.科学与技术.1995（1）：11～15

[6]江泽慧.中国现代科学全书・中国林业工程卷[M].济南：济南出版社，2002

[7]蔡定域.酿酒工业分析手册[M].北京：轻工业出版社，1988

[8]杜连祥.工业微生物学试验技术[M].天津：天津科学技术出版社，1992

[9]李兴华，陈大舟.酒精密度、浓度和温度常用数据表[M].北京：中国计量出版社，1997

[10]高路.酒糟的综合利用[J].酿酒科技.2004（5）：101～102

[11]柴政强.气相色谱分析法测定酒糟中残留酒精分[J].酿酒科技.2000（6）：102

[12]常秀莲.木质纤维素发酵酒精的探讨[J].酿酒科技.2001（2）：39～42

项目基金：本文系吉林省教育厅计划项目（吉教科合字2008第（387）号）。