β—actin基因在荒漠昆虫光滑鳖甲和小胸鳖甲中表达的稳定性研究

摘 要：为检测生活习性截然相反的两种荒漠昆虫光滑鳖甲和小胸鳖甲的β-actin基因在不同温度下的表达是否稳定，对不同温度处理和不同季节采集的昆虫提取总RNA反转录合成cDNA后，进行荧光实时定量PCR检测。以Ct值作为β-actin基因表达水平的测定值。通过方差分析显示：光滑鳖甲的β-actin基因在不同季节无显著差异，而小胸鳖甲则表现出β-actin基因表达的季节性差异；在不同温度处理条件下，光滑鳖甲β-actin基因表达比小胸鳖甲的要稳定。研究认为β-actin可作为研究光滑鳖甲不同温度下基因表达的内参基因，而β-actin则不适合用做研究小胸鳖甲在不同温度下基因表达的内参基因。

关键词：β-actin； 内参基因；光滑鳖甲；小胸鳖甲；实时定量PCR

中图分类号：S188 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.02.001

Expression Stability of β-actin Gene in the Desert Insects Microdera punctipennis and Anatolica polita

MENG Shan-shan，MA Wen-jing，LIU Xiao-ning，MA Ji

（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering， College of Life Science and Technology， Xinjiang University， Urumqi，Xinjiang 830046， China）

Abstract： In order to measuring the expression stability of the β-actin gene at different temperatures in two desert insects， Microdera punctipennis and Anatolica polita， which have quite contrary living habit，total RNA from the insects collected in different seasons， or treated at different temperatures was extracted and reverse transcribed to synthesize cDNAs. The expression of the β-actin genes from these two species was measured by Ct values which were obtained by real-time quantitative PCR. The results showed that there were no significant changes in the expression of β-actin gene in Anatolica polita over seasons， while in Microdera punctipennis the expression of β-actin gene changed significantly. When the beetles were treated at different temperatures， the expression of β-actin gene in Anatolica polita was more stable than that in Microdera punctipennis. β-actin gene in Anatolica polita could be used as a reference gene for study gene expression at different temperatures， while it is not suitable in Microdera punctipennis for study gene expression at different temperatures.

Key words： β-actin； reference gene； Microdera punctipennis； Anatolica polita； real-time PCR

β-actin是肌细胞骨架微丝的主要成分，具有收缩功能，参与胞质分裂、形态维持、生长等多种重要的生理活动，是一类高度保守的蛋白质[1]。β-actin具有分布广泛、mRNA表达量高、数量稳定等特点，因此被称为看家基因。传统的RT-PCR及实时荧定量PCR（qRT-PCR）等技术多选用看家基因作为内标来评价目的基因的相对表达量。常用的内标基因有β-actin、18SrRNA、28SrRNA和GAPDH（甘油醛3-磷酸脱氢酶）等，其中β-actin可在多个物种内持续恒量地表达，因而常被用做内参基因[2-3]。例如，粘虫的β-actin基因在6种不同组织间的表达无显著差异[4]。然而，大量研究表明，看家基因所谓的恒定表达都只是在一定类型的细胞或试验因素作用下“有范围”的恒定，在其他类型的细胞中或试验因素作用下则是变化的，有时可能是十几倍、几十倍甚至上百倍的差异，盲目地使用一种看家基因作为内参，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另一方面可能会导致错误甚至相反的结论[5-6]。通过实时定量PCR证明，actin、RPS18和GAPDH在意大利蜂的细菌胁迫前后表达最稳定，可做为内参基因[7]。GAPDH的表达随牙鲆的变态发育发生波动，β-actin较为稳定，18S是最稳定的[8]。因此，研究目标基因的表达情况时，根据样本的不同，选择合适而稳定的内参基因进行校正和标准化，将有助于得到可靠的试验结果。

小胸鳖甲（Microdera punctipennis）和光滑鳖甲（Anatolica polita borealis）是两种分布于古尔班通古特沙漠的荒漠拟步甲科昆虫[9-10]。小胸鳖甲成虫避光喜阴，夏季的白天栖居于灌丛的根部，夜晚活动，冬季藏于沙土中；光滑鳖甲成虫喜光耐热，日间活动，早晚温度较低时很少出现。古尔班通古特沙漠气候特征为典型的温带大陆性极端干旱气候，年温差和昼夜温差巨大，气温变化剧烈。这两种昆虫在此极端环境下都能克服干旱、低温和高温的影响，能很好地适应环境温度变化。利用实时定量PCR技术从基因表达水平研究它们的环境适应机制，将有助于加强人类对荒漠极端生物类群的认识。β-actin基因作为常用的内参基因，其在不同温度条件下在两种昆虫中的表达是否稳定需要鉴定，以便确定是否可以作为内参基因。

1 材料和方法

1.1 试 虫

荒漠昆虫小胸鳖甲（M.punctipennis ）和光滑鳖甲（A.polita）均采自于新疆阜康市222团（44°24N， 087°51′E）的准噶尔盆地古尔班通古特沙漠南缘地带（距离亚洲大陆地理中心约100 km）。采集时间为3月份积雪开始融化时，至11月份入冬后。采集的新鲜样本保存到液氮中，其余样本在室内培养箱内进行短期饲养，温度控制在25 ℃，光周期设置为16L∶8D，喂食饲料及蔬菜等。

1.2 试虫的温度处理

野外采集的小胸鳖甲和光滑鳖甲成虫在室温下饲养一天，待其恢复正常状况后分别取30只置于10 ℃处理5 h，然后将各组昆虫转至20，30，40 ℃ 处理5 h，使其形成10，20，30 ℃的温差。各组取出4只速冻于液氮中。另外，分别取60只昆虫置于5，10，15，37，42，47 ℃下各放置1，3，5 h。以无任何处理的试虫作为对照，各组取出4只速冻于液氮中，再转至-80 ℃超低温冰箱中，以便RNA的提取和后期相关的试验。

1.3 试 剂

Tag DNA聚合酶、DnaseⅠ、dNTP Mixture、Rnase Inhibitor、Oligo（dT）、Reverse Transcriptase M-mLV（RNase H-）、DNA Marker、 pMD19-T均为大连TaKaRa公司产品。 DNase/RNase-Free ddH2O、SYBR Green Supermix kit 为Invitrogen 公司产品；DEPC为上海生工生物工程技术服务公司产品；Trizol RNA提取试剂为Invitrogen公司产品；大肠杆菌DH 5α菌株为本实验室保藏菌种，其余所用的化学试剂（无水乙醇、三氯甲烷、异丙醇等）均为国产分析纯。

1.4 PCR引物的设计

根据GenBank中已经发表的家蚕（Bombyx mori）和果蝇（Drosophila melanogaster）以及烟草天蛾（Manduca sexta）的β-actin基因，分析它们的核酸序列同源性，在其保守位点设计用于扩增小胸鳖甲（Mp）和光滑鳖甲（Ap）β-actin基因的引物：

Mpβ-actin F 5′-TACTCCGTATGGATCGGTGGATC-3′；

Mpβ-actin R 5′-TTAGAAGCACTTGCGGTGGAC-3′；

Apβ-actin F 5′- GCGACTTGACCGACTACCT -3′；

Apβ-actin R 5′- CCGCACGATTCCATACCC -3′。

1.5 昆虫总RNA的提取及cDNA的获得

使用TRIzol法提取昆虫总RNA。将虫体置于液氮中研磨至粉末状，加入到1 mL的Trizol裂解液中，充分振荡混匀，静置 10 min后于 4 ℃，12 000 r·min-1，离心10 min。将上清转移到新离心管，加入200 μL氯仿震荡混匀，室温放置5 min后于 4 ℃，12 000 r·min-1，离心15 min。将400～500 μL上清转至新离心管中，然后加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10 min，使核酸沉淀完全（静置时有絮状沉淀物产生），4 ℃，12 000 r·min-1，离心 15 min，弃去上清，然后加入1 mL 70%的乙醇，混匀，4 ℃，12 000 r·min-1，离心5 min，（此步骤重复2遍）。弃去上清，室温干燥3 min，然后溶于DEPC处理过的水中，通过紫可见分光光度计（NanoDrop ND-1000 spectrophotometer）检测总RNA的浓度和纯度。RNA提取后加入 DNA 酶对基因组进行消化。反转录使用MLV反转录酶、dNTP Mixture、Oligo Dt、 Adaptor PrimerA（TaKaRa公司），用20 uL体系进行反应，反应条件为：42 ℃ 60 min；70 ℃ 15 min。反应结束后，将反转录产物cDNA置于-20 ℃ 冰箱保存备用。

1.6 标准质粒的构建

分别以小胸鳖甲和光滑鳖甲的cDNA为模板，以荧光定量PCR设计的引物扩增β-actin基因，1%凝胶电泳检测目的片段的大小，将PCR产物切胶回收后构建至pMD19-T 载体上，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，涂布于Amp抗性的LB平板上，挑取单个白色菌落进行培养，碱裂解法制备质粒，酶切（EcoR I/Hind III）质粒鉴定其正确性，作为制作荧光定量PCR的标准质粒。

1.7 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR反应按照操作说明（带有ROX的Platinum SYBR GREEN qPCR SuperMix-UDG，Invitrogen公司）进行，所用方法为SYBE GREENⅠ的荧光染料法。将cDNA 进行5倍稀释后备用。取2 μL逆转录产物进行PCR反应，将PCR反应的荧光检测管放入Gene Amp Thermal Cycler 9600中进行荧光定量PCR反应。每个样品重复2次。采用以下PCR反应程序，扩增小胸鳖甲β-actin基因的PCR反应条件为：50 ℃，2 min；95 ℃，5 min；95 ℃，15 s；58 ℃，30 s；72 ℃，30 s；45个循环。每次PCR程序完成后，设置72 ℃开始检测产物溶解曲线。记录Ct值。扩增光滑鳖甲β-actin的PCR反应条件为：50 ℃，2 min；95 ℃，5 min；95 ℃，15 s，59 ℃，30 s，72 ℃，30 s，45个循环。每次PCR程序完成后，设置72 ℃开始检测产物溶解曲线。记录Ct值。由于Ct值与利用标准曲线计算的拷贝数的对数在统计分析中具有相同的结果，因此我们直接采用Ct值作为表达量的计算指标。

1.8 数据分析

采用医学生物统计学软件 GraphPad Prism 4.0 对Ct值进行统计分析。分别对Mpβ-actin 和Apβ-actin在季节性表达的相对转录水平做单因素方差分析。当它们的差异显著时，则采用多重比较，进一步分析它们之间的差异性。对温度处理的数据做两因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 实时定量PCR的溶解曲线与标准曲线

经PCR反应后，仪器生成β-actin基因扩增的溶解曲线，两组曲线均无杂峰出现（图1A、B），说明试验过程中无样品污染和引物二聚体，扩增产物单一，可确定为特定的目的片段。由于片段大小不同，小胸鳖甲Mpβ-actin基因的扩增片段（120 bp）的熔解峰在82 ℃，而光滑鳖甲Apβ-actin基因扩增片段（246 bp）的溶解峰在89 ℃。

将Mpβ-actin和Apβ-actin基因片段的质粒作10倍梯度稀释（101，102，103，104，105，106，107，

109倍）进行实时定量PCR检测。结果显示在101～109范围内，Ct值与Mpβ-actin和Apβ-actin基因有较高的线性关系（图1C、D），Mpβ-actin的标准曲线的R2=0.999 1、斜率为-3.324 8、扩增效率为99.526%。Apβ-actin标准曲线的R2=0.999 1、斜率为-3.326 1、扩增效率为99.526%。这表明标准曲线可以在较宽的范围内用于Mpβ-actin和Apβ-actin基因的绝对定量。由于基因表达的绝对定量值是指数式的，不满足线性关系进行方差分析，所以在本文的分析中直接采用Ct值作为基因表达的相对指标进行各种条件下基因表达水平的比较。

2.2 小胸鳖甲和光滑鳖甲β-actin基因的季节性表达

将不同月份采集的小胸鳖甲和光滑鳖甲成虫分别用液氮处死后，提取总RNA，反转录为cDNA，进行实时定量PCR检测β-actin基因的表达。Ct值结果显示小胸鳖甲在5月和8、9月份的Ct值分别为18.02，17.94，17.99（表1），显著高于其他月份（F7，16=19.02，F0.05（7，16）=2.668 4，P0.05）（表1）。季节性表达水平的变异系数是0.011 7，小于小胸鳖甲的0.033。

2.3 小胸鳖甲和光滑鳖甲β-actin基因在不同温差条件下的表达

荒漠地区昼夜温差巨大，在夏季也经常达到30 ℃左右。检测不同温度差值对基因表达的影响是研究荒漠昆虫环境适应性分子机制的重要内容。通过 10，20，30 ℃ 温差处理昆虫后，在两种昆虫中β-actin基因的表达量都呈上升趋势，但是尚未达到显著水平（表 2）。方差分析结果显示，小胸鳖甲的F2，6，0.05=2.106，光滑鳖甲的F2，6，0.05=■，F0.05（2，6）=5.143（P>0.05）。

2.4 小胸鳖甲β-actin基因在不同温度下的表达

将小胸鳖甲成虫在不同温度（5～47 ℃）处理1，3，5 h 后，提取总RNA，反转录后进行实时定量PCR，记录Ct值（表3）。对表3中的数据进行两因素方差分析，结果表明，不同温度处理后，β-actin基因的表达量有显著差异（F7，16=3.325，F7，16，0.05=2.889，P

2.5 光滑鳖甲β-actin基因在不同温度下的表达

将光滑鳖甲成虫在5～47 ℃的不同温度处理一定时间后，提取总RNA，反转录后进行实时定量PCR，检测β-actin的表达，并以Ct值表示（表4）。结果表明，光滑鳖甲的β-actin在不同温度条件下的表达有显著不同（F5，36=4.817，F5，36，0.01=2.477，P0.05）。对不同温度的相同时间之间进行多重比较可见，只有10 ℃ 1 h、5 h和42 ℃ 1 h的Ct值显著低于其他处理，表明光滑鳖甲β-actin基因仅在10 ℃和42 ℃处理后表达水平有差异显著。

为了在小胸鳖甲和光滑鳖甲之间比较β-actin基因在不同条件下表达的稳定性，采用Ct值的变异系数进行分析。变异系数是标准差与平均数的比值，又称标准差率，反映单位均值上的离散程度。结果显示，除了37 ℃之外，光滑鳖甲β-actin基因表达的变异系数在不同温度、不同温差和季节性方面都小于小胸鳖甲的β-actin基因的变异系数（图2），说明小胸鳖甲β-actin基因的表达在不同条件下有较大的波动。

3 结论与讨论

荒漠环境对昆虫的主要影响是温度和干旱，由于昆虫是变温生物，因此昆虫对温度变化的响应是其生存适应的机制之一。为了确定今后开展荒漠昆虫基因表达研究的内参基因，本研究对不同季节、不同温差以及不同温度下两种昆虫的β-actin基因表达的稳定性进行了比较。研究结果表明，小胸鳖甲的β-actin基因在不同季节之间有显著差异，在不同温度条件下也有显著差异，这表明小胸鳖甲β-actin基因的表达受温度影响。与上述结果不一致的是，在本研究所设的温差条件下，β-actin基因的表达无显著差异，这可能是由于所设置的温差是从10 ℃以上开始的，温度变化程度还不足以引起小胸鳖甲β-actin表达变化。光滑鳖甲的β-actin基因在不同季节和温差处理下无显著差异，但在不同温度条件下个别处理（37 ℃，1 h）有显著升高，该温度对光滑鳖甲不是胁迫温度，不应该有波动，可能是实验误差所致。

季节变化包括温度、降水和光照等综合作用，由于荒漠地区温度波动的季节性很大，所以温度可能对昆虫产生主要影响。本研究发现温度对小胸鳖甲β-actin基因表达的影响大于对光滑鳖甲β-actin基因表达的影响，比较这两个昆虫在不同条件下β-actin基因表达的变异系数，可以看出，除了37 ℃以外，小胸鳖甲的变异系数均大于光滑鳖甲。究其原因可能与这两种昆虫的生活习性有关，小胸鳖甲避光喜阴，白天潜伏在沙土中，可能对温度变化比较敏感，而光滑鳖甲喜光喜温，白天在地面上活动，对高低温的耐受性较强，对温度变化的敏感性可能较低。某些生物的看家基因经高、低温胁迫后仍然能稳定表达，如对脉胞菌42 ℃处理不同时间后，tubulin基因的表达量不随处理时间变化[11]。荒漠昆虫谢氏宽漠王热激后不同恢复时间，其β-actin的表达量无明显变化，且与未经热激处理的对照相比无显著差异[12]，这与光滑鳖甲β-actin基因对温度的响应一致，因此β-actin基因可做为研究光滑鳖甲成虫在不同温度条件下的内参基因。

看家基因的表达受温度影响在其他生物中也有报道。烟草经高温胁迫后，叶内白基因和β-actin基因的表达量下降近10%，而拟南芥经高温胁迫后，其叶内白基因和β-actin基因的表达量下降近50%，并且两种基因在不同高温下的表达量都存在一定程度的差异[13]。温度对蛋白质表达的影响不仅表现在总蛋白上，也表现在对β-actin、tubulin等看家基因的表达上[11]。研究表明赤拟谷盗在真菌感染前后β-actin、α-tubulin和RPS6的表达都发生了变化[14]。所以，β-actin基因在不同昆虫体内的稳定性不同，在具体的试验开始前需要选择恰当的内参，需进一步探索在小胸鳖甲体内稳定表达的基因。

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