阿魏酸对兔主动脉血管平滑肌细胞骨架F-actin的作用

[摘要] 目的:观察阿魏酸对兔血管平滑肌细胞骨架F-actin的作用。方法:兔血管平滑肌细胞用含20%灭活胎牛血清的高糖DMEM培养,在阿魏酸作用24 h后,用鬼笔环肽标记细胞骨架蛋白F-actin后,用流式细胞仪检测荧光强度,用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架蛋白的变化。结果:阿魏酸作用24 h后,流式细胞检测结果显示,细胞骨架蛋白F-actin荧光强度明显减弱,与对照组比较,有显著性差异。激光共聚焦显微镜观察可见细胞形态明显变长,荧光减弱,与对照组比较,荧光密度减弱。结论:阿魏酸对兔血管平滑肌骨架蛋白F-actin的形成有抑制作用。

[关键词] 阿魏酸;血管平滑肌细胞;F-actin

[中图分类号] R36[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2009)07(a)-037-02

Effect of ferulaic acid on F-actin cytoskeleton of rabbit arterial vascular smooth muscle cells

ZHANG Xian, ZENG Xing, SUN Jingbo, OU Runmei, HUANG Yu

(The Central Laboratory, Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510120, China)

[Abstract] Objective: To observe the effect of ferulaic acid on the F-actin cytoskeleton of rabbit vascular smooth muscle cells (VSMCs). Methods: VSMCs were cultured with high glucose DMEM containing 20% deactivated fetal bovine serum, the cells were treated with ferulaic acid for 24 h and then F-actin was labeled with FITC-phalloidin, and the fluorescence intensity was detected with FCM, and then observed with confocal microscopy. Results: FCM result showed that F-actin of VSMCs was decreased after treated with ferulaic acid for 24 h. The fluorescence intensity of F-actin was obviously weakened, and it showed a significant difference compared with control group. The confocal microscopic observation showed that the outlines of F-actin of VSMCs were longer, and the fluorescence was weaker, and the fluorescence density was also weaker compared with control group. Conclusion: Ferulaic acid can inhibit F-actin formation of VSMCs.

[Key words] Ferulaic acid; Vascular smooth muscle cells; F-actin

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖及其向内膜下迁移是动脉粥样硬化、高血压、血管成形术后再狭窄等多种心血管疾病的共同病理基础,在平滑肌细胞增殖和迁移过程中依赖于细胞骨架蛋白的改变[1]。阿魏酸(ferulaic acid,FA),化学名为4-羟基-3-甲氧基苯丙烯酸,是一种有机酚酸,是当归、阿魏、川芎、升麻、木贼等多种活血化瘀中药的有效成分之一,具有多种药理作用,动物实验表明FA具有拮抗动物VSMCs增殖的效应,对高血压病患者小动脉VSMCs具有抑制作用,可直接抑制VSMCs的黏附、迁移和游离Ca2+浓度升高,抑制其迁移[2-6],但目前仍少见其对血管平滑肌骨架蛋白的研究。本实验观察阿魏酸对动脉血管平滑肌骨架蛋白F-actin的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂

高糖DMEM、胎牛血清为Gibco公司产品,异硫酸氢荧光素-鬼笔环肽(FITC-phallodin)、RNA酶、牛血清清蛋白均为Sigma公司产品,碘化丙啶(prodidium iodide,PI)为Coulter公司产品。FA购于广东省药品检验所。

1.2 实验仪器

SP型激光共聚焦显微镜(Leika),ELITE ESP型流式细胞仪。

1.3 方法

1.3.1细胞培养兔主动脉平滑肌细胞(SMC)购于中国医学科学院细胞中心。SMC细胞培养于含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基中,置37℃、5% CO2培养箱中培养。每周更换2次培养液,用0.25%-0.02% EDTA的胰酶消化传代培养。

1.3.2 倒置显微镜观察阿魏酸作用24 h后,在倒置显微镜下观察细胞。

1.3.3 激光共聚焦样品制备取出培养细胞爬片,用磷酸缓冲液(PBS)洗2遍,4%多聚甲醛溶液4℃固定过夜,用PBS轻洗2遍,0.2% Triton X-100室温下渗透10 min,再用PBS轻洗2遍,加入2 μg/ml RNA酶37℃作用30 min,用PBS轻洗2遍,1%牛血清清蛋白覆盖,室温作用20 min(不洗),5 μg/ml(PBS稀释)FITC-phallodin室温下避光染色35 min,PBS洗2遍后加入200 μl PI染液,室温避光染色30 min,甘油封片,上机观察。

1.3.4 流式样品制备取出24孔培养板,吸去上清,用PBS洗2遍,同激光共聚焦标本一样固定、渗透、洗涤、FITC-phallodin及PI染色,染色完毕后,吹打并吸出细胞悬液,加入PBS离心洗涤,弃上清,加入300 μl PBS重悬细胞,上机分析。

1.4 统计学处理

数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 10.0统计软件进行单因素方差分析,P

2 结果

2.1阿魏酸对VSMCs细胞形态的影响

从倒置显微镜下观察,对照组的细胞呈多角形或短梭形,细胞多有板状突起。在加入阿魏酸24 h后,与对照组比较,阿魏酸0.1 mg/ml组与对照组接近;0.5 mg/ml组细胞多细长,呈梭形,少见分裂象细胞;1.0 mg/ml组细胞形态细长,未见分裂象细胞。见图1。

图1 阿魏酸对兔VSMCs形态的影响

(A.对照组;B.FA 0.1 mg/ml组;C.FA 0.5 mg/ml组;D.FA 1.0 mg/ml组)

2.2 阿魏酸对VSMCs细胞骨架的影响

2.2.1 流式细胞仪检测阿魏酸对VSMCs细胞骨架F-actin含量的影响在阿魏酸作用24 h后,与对照组比较,阿魏酸0.5 mg/ml和1.0 mg/ml组VSMCs细胞内F-actin的荧光强度明显减低,与对照组比较,有显著性差异(P

表1 阿魏酸对兔血管平滑肌细胞F-actin荧光强度的影响(x±s)

与对照组比较,*P

2.2.2 激光共聚焦观察阿魏酸对VSMCs细胞骨架F-actin的影响对照组可见较明显的F-actin存在,纵向平行排列,可见整齐的应力纤维丝,贯穿细胞长轴。在阿魏酸作用24 h后,0.1 mg/ml组细胞内F-actin未见明显变化;0.5 mg/ml组细胞内F-actin减少,应力纤维丝排列较散在;1.0 mg/ml组细胞内F-actin明显减少,或仅存在少许无规则、散在分布的F-actin。见图2。

3 讨论

真核细胞骨架由微丝、微管和中间丝组成。肌动蛋白(actin)是构成微丝的基本成分,以单体(G-actin)或聚合体(F-actin)形式存在,不仅出现在具有收缩能力的骨骼肌原纤维中,而且也出现在平滑肌细胞中。肌动蛋白具有收缩、保持细胞的形状、运动、细胞间黏附等多种功能,同时参与细胞增殖过程[7]。血管平滑肌细胞是血管壁的主要成分,其增殖及向内膜下迁移在动脉粥样硬化、高血压、血管成形术后再狭窄等多种心血管疾病的病理过程中有重要作用[8-9],在此过程中依赖于细胞骨架蛋白的改变。研究证明,阿魏酸钠具有拮抗VSMCs增殖的效应,可直接抑制VSMCs的黏附、迁移和游离Ca2+浓度升高,抑制其迁移[10],但目前仍少见其对血管平滑肌骨架蛋白的研究。本试验观察阿魏酸对动脉血管平滑肌骨架蛋白F-actin的影响。通过对阿魏酸作用的VSMCs的直接观察和对其F-actin染色后的流式细胞术和激光共聚焦的观察,发现阿魏酸对VSMCs的形态有明显的影响,能使细胞形态变狭长、处于较稳定的分化形态,同时使肌动蛋白聚合体F-actin的形成和荧光强度明显降低,这些结果提示阿魏酸能抑制VSMCs F-actin的形成,这可能是阿魏酸抑制VSMCs增殖和迁移的途径之一。

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(收稿日期:2009-02-24)