肝癌及癌周组织核转录因子-κB表达的免疫组织化学分析

【摘要】目的：研究核转录因子（NF）-κB在肝癌和癌周组织中的表达及其临床病理学关系。方法：以自身配对法分别收集经手术切除患者的肝癌及其癌周组织各35份，以免疫组化染色法检测肝癌及其癌周组织NF-κB表达、胞内分布，以及病理学特征。结果：NF-κB阳性表达物呈棕黄色颗粒状染色，癌组织中NF-κB点灶状表达，定位于胞浆和细胞核；而癌周组织NF-κB阳性表达主要定位于胞浆，未见细胞核阳性。定性观察肝癌组织中NF-κB表达强度明显高于癌周组织，癌组织NF-κB表达阳性率为100%，癌周组织为68.6%，二者比较差异有非常显著性（χ2=13.1，P＜0.01）。肝癌组织中NF-κB的表达强度与分化程度、肿瘤数目、HBsAg和肿瘤直径无关。结论：肝癌组织中NF-κB过表达，与肝癌的发生、发展密切相关。

【关键词】癌；肝细胞；NF-κB；免疫组织化学；表达

文章编号：1009-5519（2008）12-1746-03 中图分类号：R73 文献标识码：A

核转录因子（NF）-κB是与免疫球蛋白κ轻链增强子B区结合，具有和某些基因上启动子区固定核苷酸序列结合而启动该基因转录的蛋白质。NF-κB是具有多向性调节作用的核转录因子，可调控多种基因(免疫、炎症反应、病毒和原癌基因)的转录表达[1]。激活的NF-κB参与癌症的启动、发生及发展过程，在炎症性相关的肝癌（HCC）发生发展中呈高表达，在肝细胞炎症与癌变间起桥梁作用，其中包括肝脏免疫炎症反应相关基因、肝炎病毒相关基因和原癌基因的转录表达。在肝癌组织中异常激活，可抑制细胞凋亡，促进肝细胞存活，与肝癌的发生发展密切相关[2]。本文采用免疫组织化学方法，分析了按自身配对法留取的肝癌患者术后肝癌的癌灶组织和癌周组织标本中NF-κB表达、胞内分布及其临床病理特征。

1 材料和方法

1.1 研究对象：于2005～2007年间，按自身配对法收取南通大学附属医院原发性肝癌患者35例(男29例，女6例)术后新鲜肝脏组织，分别留取肝癌切除后的癌灶组织、癌周组织(距癌灶边缘5 cm)各35份(每份约200 mg)，除部分作组织病理学检查外，其余置组织-85℃保存。35份标本中肝癌肿块直径≥5 cm 7例，

1.2 试剂与标本切片：兔抗人NF-κB多克隆抗体及S-P免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。新鲜肝组织标本经取材，以10％中尔马林固定，石蜡包埋，制成厚度4 μm的组织切片。

1.3 免疫组织化学分析NF-κB（S-P法）：NF-κB在癌组织和癌周组织中的表达均采用免疫组织化学S-P法。4 μm厚的组织切片按常规脱蜡、水化；双氧水阻断内源性过氧化物酶；高压加热法修复抗原；正常动物血清封闭非特异性结合；滴加NF-κB抗体，4 ℃过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗；滴加生物素标记的第二抗体，室温孵育10 min，PBS漂洗；滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶，室温孵育10 min，PBS冲洗；滴加新鲜配制的四盐酸二氨基联苯胺(DAB)溶液，室温显色，蒸馏水洗涤；苏木素复染。无水乙醇脱水透明、封片。OLYMPUS BX 50光学显微镜观察、摄像。以0.01 mol/L PBS液(pH=7.5)分别替代一抗、二抗和SP试剂作阴性对照，已知表达NF-κB的肝癌组织作阳性对照。

1.4 NF-κB判断标准：肝组织中NF-κB表达强度，以阳性细胞数≥10%作为阳性判断标准，进而根据阳性细胞百分率分为NF-κB表达弱阳性(+)：阳性细胞数为10%～25%；NF-κB表达阳性(++)：阳性细胞数为26%～75%；NF-κB表达强阳性(+++)：阳性细胞数>75%。

1.5 统计学处理：以stata7.0统计软件分析和处理数据。计数资料以卡方检验或Fisher确切概率法分析和处理，以P

2 结果

2.1 肝癌组织中NF-κB表达的胞内分布与定位：肝癌组织及其癌周组织中NF-κB阳性表达呈棕黄色。癌组织中NF-κB表达呈巢状分布，深染，细胞胞浆和细胞胞核均呈阳性；而它对应的癌周组织NF-κB阳性表达，主要定位于胞浆，而细胞核无明显的阳性着色。镜下定性观察肝癌组织中NF-κB表达强度明显高于癌周组织。

2.2 肝癌与癌周组织中NF-κB表达差异：肝癌的癌灶组织与癌周组织中NF-κB表达差异见表1。

2.3 肝癌组织NF-κB表达的病理学特征分析：见表2。NF-κB在癌组织的阳性率为100%，其NF-κB表达强度与肿瘤的分化程度、肿瘤数目、HBsAg和肿瘤大小间的关系，经确切概率法分析，各组间均差异无显著性(P>0.05)。

2.4 癌旁组织NF-κB表达的病理学特征分析：癌旁组织中NF-κB表达与癌灶组织相比，表达强度低，有近1/3的癌旁组织中未见NF-κB的表达。NF-κB表达的病理学特征见表3，NF-κB在癌旁组织的阳性率为68.6%(24/35)，NF-κB表达强度与分化程度、肿瘤数目、HBsAg、肿瘤直径间的关系，经确切概率法分析，各组差异无显著性(P>0.05)。

3 讨论

NF-κB是一个具有广泛生物活性的转录因子，受多种信号途径调控，同时也调控多种信号途径，作为细胞内信号传递的一个枢纽参与多种生理过程的调控，其表达异常会导致机体的多种病理改变[3]。NF-κB主要存在于胞质中，与NF-κB抑制蛋白(IκB)家族成员结合，形成无活性的三聚体。当其受到细胞因子、有丝分裂原、病毒等刺激后，IκBα通过磷酸化、泛素化而降解，从而使NF-κB的核定位信号暴露，NF-κB进入到细胞核内，与靶基因的κB位点结合，从而发挥其转录调节作用[4]。NF-κB在炎症与肿瘤的联系中起作用，是调控癌细胞凋亡的主要因子，能调节肿瘤的血管生成与侵袭能力[5]。我们采用免疫组织化学方法，分析了人肝癌及癌周组织中NF-κB的组织分布及其临床病理特征。在众多被感染和炎症所活化的信号途径中，NF-κB也许是肿瘤促进机制中最重要的一环，因为NF-κB是抗凋亡基因表达的主要激活子。研究中发现NF-κB的表达阳性率在肝癌组织明显高于癌周组织，且阳性强度亦明显高于癌周组织，对照临床资料分析发现在肝癌组织中NF-κB的阳性率及强度与分化程度、肿瘤数目、肿瘤直径均未见统计学差异，是否与病例选择有关，还有待探讨。NF-κB表达的定位分析发现，在肝癌组织中有点灶状的胞核阳性，而在癌周组织未发现有胞核阳性，提示NF-κB在激活后进入胞核发挥其转录活性，从而参与肝癌的发生发展[6]。

HCC是由病毒、化学致癌物等多病因作用，因癌基因或癌相关基因激活、抗癌基因失活或胚胎期某些酶基因重新复活等诸多因素引起肝细胞生长失控而致癌变，经启动、促进、演变多阶段的发病过程，并与基因调控和表达等密切相关[7]。肝炎病毒(HBV和HCV)的慢性持续感染是肝癌发生的主要背景[8]。文献报道HBV病毒感染诱导和激活NF-κB表达，但在本组资料中仅分析NF-κB表达与HBsAg之间的关系，结果显示HBsAg阳性的病例癌组织与癌周组织NF-κB强度均有高于HBsAg阴性病例的趋势，在统计学上未见有明显差异。在肝癌组织中NF-κB表达与HBV复制的关系待进一步研究。

多基因、多阶段癌基因或抑癌基因变异，构成肝癌发生、发展的分子基础[9]。NF-κB表达，受多种信号途径调控，同时也调控多种信号途径，作为细胞内信号传递的一个枢纽参与多种生理过程的调控。肝癌发生过程中NF-κB过度表达，参与了肝癌的发生、发展[10]。NF-κB通过上调抗凋亡基因的表达等作用抑制细胞凋亡，从而参与肿瘤的发生发展，其在调控肿瘤的发生发展及凋亡的复杂信号网络中处于中心环节，在肝细胞炎症与癌变间起桥梁的关键作用，因此有望成为临床上肝癌基因治疗的理想靶点。

参考文献：

[1] Karin M.Nuclear factor-kappaB in cancer development and progres-sion[J]. Nature，2006，441：431.

[2] 姚登福，苏小琴.肝细胞核因子-κB异常激活与肝细胞癌变[J].中华肝脏病杂志，2006，14（7）：539.

[3] Karin M，Greten FR. NF-kappa B: linking inflammation and immuni-ty to cancer development and progression[J].Nat Rev Immunol，2005，5：749.

[4] Moynagh PN.The NF-kappaB pathway[J]. J Cell Sci，2005，118：4589.

[5] Danial NN，Korsmeyer SJ.Cell death：critical control points[J]. Cell，2004，116：205.

[6] 董志珍，姚登福，苏小琴，等.肝癌形成过程中基因表达谱及转录核因子-κB动态改变[J]. 肝病学和胃肠病学杂志，2007，16(6)：580.

[7] Li Q，Withoff S，Verma IM. Inflammation-associatedcancer：NF-kappaB is the lynchpin[J]. Trends Immunol，2005，26：318.

[8] Raza SA，Clifford GM，Franceschi S.Worldwide variation in the rela-tive importance of hepatitis B and hepatitic C viruses in hepatocellu-lar carcinoma: a systematic review[J].Br J Cancer，2007，96：1127.

[9] Thorgeirsson SS，Grisham JW.Molecular pathogenesis of human hep-atocellular carcinoma[J]. Nat Genet，2002，31：339.

[10] Su XQ，Wu XH，Wu W，et al. Kinetic alterations of liver nuclear factor-kappa B and TNF-α expression at the early stage of HCC occurrence and clinical significances of their quantitative analysis (Abstract)[J]. J Gastroenterol Hepatol，2006，21(S2)：A169.

收稿日期：2008-02-22