NF-κB对肝癌细胞自噬形成的影响

[摘要] 目的 研究抑制核转录因子（nf-κB）对肝癌细胞HepG2自噬的作用及影响。 方法 常规培养HepG2细胞后分为两组：SN50处理组及空白对照组，然后采用MTT比色法检测细胞生长增殖、Western blot检测细胞内微管相关蛋白LC3-Ⅱ水平以及MDC染色后，采用荧光显微镜对自噬进行定性观察。 结果 经SN50处理24、48、72 h后，细胞增殖抑制率分别为（20.45±3.70）%、（31.94±4.20）%和（36.44±4.60）%（P ＜ 0.05），自噬相关蛋白LC3-Ⅱ水平的表达上调，同时荧光染色也提示肝癌细胞自噬活性增强。 结论 阻断NF-κB可以在一定时间内显著抑制HepG2细胞的增殖，其机制可能是增强了细胞的自噬作用。

[关键词] 肝癌细胞HepG2；SN50；自噬；NF-κB；微管相关蛋白LC3

[中图分类号] R329 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）07（a）-0035-03

Effect of NF-κB on autophagy formation of human hepatoma cell

HAO Gaopeng WANG Shiming DONG Xiushan REN Ning FAN Yue LU Yudong

Department of General Surgery, the Affiliated First Clinical Medical School of Shanxi Medical University, Shanxi Province, Taiyuan 030001, China

[Abstract] Objective To research the effect of NF-κB on autophagy formation of Human Hepatoma Cell HepG2. Methods The human hepatoma cell HepG2 was cultured in vitro and divided into SN50 group and control group, MTT assay was used to test the cell growth dynamically. Western blot analysis was performed to assess the expression of LC3-Ⅱ. The autophagy was observed using fluorescent microscope by monodansylcadaverin (MDC) staining. Results The inhibition ratio of HepG2 cells were (20.45±3.70)%, (31.94±4.20)% and (36.44±4.60)% after treatment of SN50 for 24, 48 and 72 h, the difference was statistically significant than before (P < 0.05). The expression of LC3-II had upregulation and fluorescent staining revealed the activity of autophagy. Conclusion Blocking of NF-κB can significantly inhibit the proliferation of HepG2 cells in a certain period of time, and the effect may associated with increased cell autophagy.

[Key words] Human hepatoma cells HepG2; SN50; Autophagy; NF-κB; Microtubule-associated protein LC3

迄今的研究显示NF-κB在多种原发肿瘤中高表达，在恶性肿瘤的发生发展过程中起着非常重要的作用[1]。NF-κB通过调节多种基因的转录从而影响肿瘤细胞的增值、凋亡以及肿瘤的发生等过程；而SN50作为NF-κB的特异性抑制剂[2]，已被广泛用于该通路的研究以及以NF-κB为靶点的疾病治疗[3]。笔者基于已有的知识和研究成果，研究肝癌细胞的自噬活性以及通过使用SN50初步探讨了NF-κB信号通路对肝癌细胞自噬活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

HepG2细胞由山西医科大学寄生虫实验室提供，高糖DMEM培养基购自Neuronbc公司，胎牛血清为北京元亨金马生物技术开发有限公司产品，胰蛋白酶和MTT购自美国Solarbio公司，SN50购自美国Sigma公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自碧云天试剂公司，微管相关蛋白Ⅰ轻链子（LC3）一抗购自BOSTER公司。

1.2 细胞培养

将HepG2细胞置于37℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养，每3天传代1次，细胞贴壁达到70%时，以体积分数0.25%胰酶消化，使瓶底细胞都浸入溶液中，倒置镜下观察细胞，在贴壁的细胞逐渐变圆后，但是在尚未漂起时加入5 mL培养液终止消化，用吸管吹打贴壁细胞，然后分到另外的两个培养瓶中，加入新鲜培养基后置于37℃、体积分数5%CO2的培养箱中继续培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 SN50对HepG2细胞增殖的影响

将HepG2细胞按1 000～10 000个细胞每孔接种于96孔板中，调整为每孔0.1 mL，培养过夜；共设两组：SN50处理组加入浓度为20 μmol/L的SN50，空白对照组加入等体积生理盐水，每组均设3复孔，分别培养24、48、72 h；PBS洗涤后每孔加0.1 mLPBS和10 μL MTT染液（终浓度为500 μg/mL），置于37℃、含5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4～6 h；每孔加0.1 mL含10％SDS的10 mmol/L HCl，放置过夜，酶标仪检测波长为570 nm时的吸光度（A）值，重复3次。计算肿瘤细胞生长抑制率：肿瘤细胞生长抑制率（％）=[（A对照组-A实验组）/A对照组]×100% 。