Smad7 mRNA和NF―κBp65 mRNA及其蛋白在肝癌患者中的表达

时间:2022-08-28 01:28:16

[摘要]目的 分析Smad7与NF-κBp65在原发性肝细胞性肝癌(HCC)中的表达、临床意义及两者之间的关系。方法 选择2005年12月~2010年12月顺德第一人民医院外科手术切除送检至病理科的腊块标本120例檠芯慷韵螅其中正常肝组织10例、肝炎组织30例、肝硬化组织30例、HCC组织50例。采用免疫组化S-P法和石蜡切片原位杂交法检测各肝组织中Smad7 mRNA、NF-κBp65 mRNA及其蛋白的表达情况。结果 Smad7蛋白、NF-κBp65蛋白、Smad7 mRNA、NF-κBp65 mRNA在HCC组织中的阳性表达率均明显高于肝硬化、肝炎和正常肝组织(P

[关键词]Smad7;核因子NF-κB;免疫组化;原位杂交

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2017)02(a)-0008-04

[Abstract]Objective To study the expression of Smad7 and NF-κBp65 in HCC and their relationship.Methods 120 cases of specimen from patients carried surgical resection in the First People′s Hospital of Shunde of Southern Medical University from December 2005 to December 2010 were selected as the research object,including 10 cases of normal hepatic tissues,30 case of cirrhosis,30 cases of hepatitis and 50 cases of HCC.Immunohistochemistry and in situ hybridization were used to detect the changes of Smad7 mRNA and NF-κBp65 mRNA and their proteins expressions in each kinds of hepatic tissues.Results The positive expressions rate of Smad7 mRNA and NF-κBp65 mRNA and their protein in HCC tissues were significantly higher than those in the cirrhosis tissues,hepatitis tissues and normal hepatic tissues,the differences were statistically significant (P

[Key words]Smad7;Nuclear factor-kappa B;Immunohistochemistry;In situ hybridization

肝细胞癌的死亡率在恶性肿瘤中位居第三,约占成年人原发性肝脏肿瘤80%,其发病率也居高不下[1-2],且肝细胞癌患者早期症状不明显,经常延误诊断,从而使其治疗方法非常有限[3],主要是手术切除及肝移植。虽然原发性肝细胞性肝癌(primary hepatocellular carcinoma,HCC)的发生和发展被认为与肝炎、肝硬化有关,但还不清楚其中的分子机制。目前认为,HCC的发生演变可能是一个多基因、多步骤的过程,Smad7是TGF-β下游非常重要的信号蛋白,被认为与器官硬化和肿瘤发生有关。核因子-κBp65(nuclear factor-kappa Bp65,NF-κBp65)的活化已被证实在多种肿瘤细胞中存在。本研究通过检测HCC组织中Smad7和NF-κBp65的表达,探讨其辅助临床诊断及治疗的价值。

1对象与方法

1.1对象

选择2005年12月~2010年12月顺德第一人民医院外科手术切除送检至病理科的腊块标本120例为研究对象,其中正常肝组织10例、肝炎组织30例、肝硬化组织30例、HCC组织50例。HCC患者按照Edmondson标准分级,Ⅰ~Ⅱ级24例,Ⅲ~Ⅳ级26例;年龄28~71岁,平均56.5岁;男47例,女3例。肝硬化患者年龄25~69岁,平均50.6岁;男22例,女8例。慢性肝炎患者中,轻、中、重度慢性肝炎各10例;年龄6~51岁,平均34.8岁;男28例,女2例。切片厚度均为4 μm。正常对照肝组织采用经病理科HE染色,切片被诊断并证实为未发生病变的成人肝脏腊块标本再重新切片获得。

1.2方法

鼠单抗NF-κBp65购自美国Santa Crus公司,鼠单抗Smad7、Smad7 mRNA和NF-κBp65 mRNA原位杂交检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。应用免疫M化S-P法,实验步骤按说明书进行,DAB显色5 min。阳性对照由试剂公司提供,阴性对照由PBS缓冲液代替一抗作参照。原位杂交方法:石蜡切片常规脱水、浸蜡、包埋。氨丙基三乙氧基硅烷处理玻片,脱蜡至水,暴露核酸片段,后固定,预杂交,杂交(过夜),洗涤,封闭,滴加生物素化鼠抗地高辛等,EAC显色后依次进行常规步骤,最后封片[4]。

1.3结果判定标准

采用双盲法对两种染色结果进行观察[5],每张切片随机选择5个高倍视野(×400),随机选取200个实质细胞,计算阳性细胞占比,最后计分:≤25%记1分,>25%~75%记2分,>75%记3分。将染色强度分为3级:阴性着色1分,弱着色2分,棕黄色3分;采用半定量积分法,根据两者的乘积判断结果,≥3分为阳性,

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析,计数资料用率表示,组间比较采用χ2检验或四格表概率法,以P

2结果

2.1 各肝组织中Smad7蛋白与NF-κBp65蛋白的表达情况

Smad7蛋白在HCC中的阳性表达率均明显高于肝硬化、肝炎及正常肝组织,差异均有统计学意义(χ2=6.036、19.217、17.286,均P

2.2 Smad7 mRNA和NF-κBp65 mRNA在各肝组织中的表达情况

Smad7蛋白在HCC中的阳性表达率均明显高于肝硬化、肝炎及正常肝组织,差异均有统计学意义(χ2=5.524、16.254、16.000,均P

A.Smad7蛋白在HCC组织中的表达(SP,×400);B.Smad7 mRNA在HCC组织中的表达(SP,×400);C.NF-κBp65 蛋白在HCC组织中的表达(SP,×200);D.NF-κBp65 mRNA在HCC组织中的表达(SP,×200);箭头所示为阳性表达细胞

2.3 Smad7和NF-κBp65在HCC组织的表达与相关临床病理因素的关系

Smad7蛋白在HCC中的阳性表达与各因素均无关(P>0.05);NF-κBp65蛋白在HCC中的阳性表达与肿瘤直径有关(P0.05)(表3)。

2.4 HCC中Smad7蛋白和NF-κBp65蛋白表达的关系

HCC组织中Smad7蛋白与NF-κBp65蛋白的表达密切相关(χ2=4.578,P=0.02)(表4)。

3讨论

转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族是一种具有重要生物效应的细胞因子,有三种亚型(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3),在细胞的生长、分化、迁移、凋亡、免疫调节等方面发挥重要的调节作用。其中含量最高的是TGF-β1,它可以活化和促进血管生成相关因子的表达,促进肿瘤中血管系统形成,从而促进肿瘤的发展[6]。有研究报道在多种恶性肿瘤中TGF-β1高表达[7-8]。Smads蛋白家按功能分为3类:受体活化型Smad(R-Smads)、共同通路型Smad(Co-Smad)和抑制性Smad(I-Smads)。Smad 7属于抑制型I-Smads,抑制TGF-β家族的信号转导。本研究结果显示,在4种肝组织中,Smad7蛋白及其mRNA的表达率有明显差异性,在HCC中的表达明显高于其他3种组织。主要是由于Smad7作为TGF-β1信号转导通路的抑制元件,通过干扰Smad2、Smad3的磷酸化和Smad-2,3,4异源复合物的形成而发挥作用,导致细胞的无限制生长[9]。即Smad7的高表达通过反馈调控使TGF-β1对细胞生长、增殖的抑制能力降低,加速细胞的恶性转化[10]。有研究显示Smad7基因与结肠癌患预后有着密切的关系,Smad7高表达被认为是恶性细胞抑制TGF-β的生长作用的机制之一[11-12]。有研究还提示,不依赖TGF-β,Smad7可发挥独立分子生物学作用,并在肿瘤细胞的凋亡中发挥重要作用[13-15]。由于在肝硬化中的表达明显高于正常肝组织中,研究表明TGF-β1还可使细胞外基质胶原含量增加,促使胶原纤维和纤维蛋白的形成[16-17],而抑制因子Smad7主要通过阻断TGF-β的激活及其信号的转导,发挥反馈调节功能,抑制器官纤维化与硬化。

核因子NF-κB 是炎症与癌的重要中介分子,许多细胞、病毒的基因组中存在κB位点,因而众多基因转录可以被NF-κB 调控[18-20],如肝脏炎性反应相关基因、肝炎病毒相关基因、原癌基因、抑癌基因等多种基因都可以被其通过多种方式参与表达[21]。而NF-κBp65是哺乳动物细胞5种NF-κB(p65、RelB、C-Rel、p50和p52)中含量最丰富的一种,本研究结果显示NF-κBp65在HCC组织中的表达明显高于在其他几种肝组织中,并与肿瘤直径有关,且差异有统计学意义(P

分析Smad7和NF-κBp65的关系时发现两者具有一定的相关性(χ2=4.578,P

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(收稿日期:2016-11-23 本文编辑:任 念)

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