展望CRISPR/Cas9基因编辑技术在药用植物研究中的应用

[摘要] CRISPR/Cas9基因编辑技术是近几年新发现的一种基因组定点编辑技术，该技术已经广泛应用在基因治疗、基因功能研究、动物模型制造、农作物品种改良等领域的研究中。该文简要介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术，并提出了这项技术在药用植物功能基因组学研究、活性成分次生代谢及合成生物学研究、药用植物分子育种研究等方面的应用前景，为开辟药用植物新领域的研究提供了参考。

[关键词] 药用植物； CRISPR/Cas9； 基因编辑技术

基因编辑技术在生物学研究中展现出了广阔的应用前景，已经成为基因改造和功能基因研究中不可或缺的技术手段，是一项可以与分子克隆、 PCR 等技术相媲美的技术突破[1]。由于CRISPR/Cas9系统具有强大的技术优势，一经报道便迅速成为分子生物学领域研究的热点，在推动基因治疗、基因功能研究、动物模型制造、农作物品种改良等领域发挥了巨大的作用。目前，该技术除了在细胞和动物水平展开应用之外，在多种模式植物及农作物的研究中也得到了广泛应用，例如拟南芥[2]、烟草[3]、水稻[4]、小麦[4]、玉米[5]、高粱[6]、番茄[7]、大豆[8]、甜橙[9]等。本文参考CRISPR/Cas9技术在其他领域中的研究方法和进展，展望其在药用植物功能基因组学研究、活性成分次生代谢及合成生物学研究、药用植物分子育种研究等方面的应用。

第一代基因组编辑系统锌指核酸酶[10]（Zincfinger nucleases，ZFNs）系统和第二代基因编辑系统类转录激活因子效应物核酸酶[11]（transcription activatorlike effector nucleases，TALENs）系统均是利用蛋白与 DNA 结合的方式靶向编辑特定的基因组位点，但由于二者组装复杂且成本高，其推广应用受到了一定的限制。近期韩春雨团队发明了一种最新的基因组编辑技术，即NgAgogDNA（Natronobacterium gregoryi argonauteguide DNA）技术[12]。NgAgo是一种DNA介导的核酸内切酶，初步研究表明该技术在靶基因选择广泛性和脱靶效率等方面较CRISPR/Cas9系统有一定的优势，但目前该技术仅在人类细胞中进行过试验，且在NgAgo蛋白的模块化程度、多位点编辑能力等方面还有待进一步考察。CRISPR/Cas[13] （clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPRassociated protein）系统，是继ZFNs和TALENs系统之后的第三代基因编辑系统，通过简单的核苷酸互补配对方式与特定的位点结合，即可实现对靶基因的编辑，其实验设计简单、操作简便、成本低，目前已经成为应用最为广泛的基因组编辑技术。

1.1 CRISPR/Cas系统的组成 CRISPR，即成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats），由高度保守的重复序列和不同的间隔序列交替排列组成，间隔序列可特异性识别外源DNA。CRISPR/Cas广泛存在于古生菌和细菌中，属于获得性免疫系统，可以将入侵的噬菌体或质粒DNA特征片段整合到自己的基因组中成为间隔序列，形成记忆性免疫，当这些外源入侵者再次入侵时，系统就会自动行使特异性识别和剪切功能[1416]。CRISPR 基因座由crRNA（CRISPR RNA）与反式激活crRNA即tracrRNA（transactivating CRISPR RNA）复合物、Cas蛋白编码基因、前导序列（leader sequence）以及CRISPR序列组成，这些部件共同参与CRISPR/Cas系统的免疫防御功能[17]。

1.2 CRISPR/Cas系统的工作原理 CRISPR 系统分为 3 种类型，Ⅰ型和Ⅲ型系统均需多种Cas蛋白形成复合体才能行使切割功能[1819]，而Ⅱ型系统的特征性蛋白仅为1个Cas9蛋白，该蛋白具有加工产生crRNA和切割外源核酸的功能，Cas9 蛋白、crRNA 和tracrRNA三者共同作用即可对外源 DNA 进行靶向裂解[2021]。现在常用的CRISPR/Cas9系统即由Ⅱ型系统改造而来[22]（图1）。

当噬菌体或质粒DNA入侵宿主细胞时，Cas9 蛋白靶向并裂解噬菌体基因组中的原型间隔序列（protospacer），并将其整合到宿主基因组的 CRISPR 位点，然后将这些间隔序列转录成crRNA，在 Cas9蛋白的参与下，靶向切割入侵的噬菌体 DNA 序列，与此同时，重复序列截取噬菌体的某些 DN段形成CRISPR间隔序列，当同种噬菌体再次入侵时，间隔序列将会转录形成crRNA，这些 crRNA 与tracrRNA形成二级结构，与Cas9蛋白形成复合体，识别紧随原型间隔序列后的原型间隔序列毗邻基序（protospacer adjacent motif，PAM），Cas9蛋白的核酸酶结构域切割与 crRNA 互补的双链DNA形成DNA双链断裂（DSBs，DNA doublestrand breaks）。真核生物细胞内存在着2种DNA修复方式，可以主动修复DSBs。一种是非末端同源交连（NHEJ，nonhomologous endjoining），修复后的DNA双链经常出现个别碱基的缺失或插入，从而导致基因功能的改变；另一种是同源重组修复（HDR，homologydirected repair）方式，常引起碱基的替换。在自然条件下，同源重组修复出现的概率极低，因此细胞中DSBs的修复方式以NHEJ为主[23]，所以，经过CRISPR/Cas9系统编辑后的基因多导致基因功能的丧失。后来研究者们在深入了解CRISPR/Cas9系统的工作原理后，用一种含有发卡结构的sgRNA代替crRNAtracrRNA复合体系，并从链农杆菌S. pyogenes中得到Cas9蛋白编码序列，成功将这一技术简化到实验室研究中[22]。

1.3 CRISPR/Cas9基因编辑技术的优势 与其他基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9技术具有显著的优势。主要体现在以下几点：①设计简单，适用范围广。只要靶基因序列中含有NGG的PAM位点[22]，即可将NGG上游20个碱基设计为sgRNA，靶向识别该序列，并在Cas9蛋白的切割作用下实现对靶基因的编辑。几乎所有的基因中都含有多个PAM序列，因此，CRISPR/Cas9系统能够对基因组中绝大多数基因进行编辑，而相比之下，ZFNs和TALENs系统对靶序列的限制较多，设计过程较为复杂，适用范围相对较小。②对植物基因组编辑的特异性较高。目前的研究成果表明，CRISPR/Cas9技术对大型复杂基因组，例如人类基因组等，进行编辑时存在较高的脱靶率，在小鼠和斑马鱼中存在较低的脱靶率[2425]，但在植物研究领域，除了在对六倍体植物小麦的基因组进行编辑时存在个别脱靶之外[26]，在其他植物，如拟南芥、烟草中均未发现脱靶现象[23]。③能够同时编辑多条基因。只要针对不同的基因设计不同的sgRNA，并将其与Cas9蛋白编码序列构建到同一个转化体系中，便可一次性实现对多个基因的改造，CRISPR/Cas9技术的应用大大提高了基因组编辑效率[27]。④能够获得无外源基因插入的转基因植物。传统的转基因技术往往会将筛选基因、报告基因等外源基因插入到植物基因组中，并且稳定遗传给后代，而CRISPR/Cas9系统的编辑位点和插入位点不同，外源基因可以在后代的分离过程中被去除，从而获得无外源基因插入的遗传改良品种，提高社会对转基因植物的接受程度。

2 展望CRISPR/Cas9 基因编辑技术在药用植物研究中的应用

2.1 药用植物功能基因组学研究 在生物学基础研究领域，CRISPR/Cas9系统可以实现基因的敲除、插入、定点替换、染色体重组和多基因敲除等，可以从反向遗传学的角度快速解析基因功能及基因间的相互作用。目前，大部分药用植物的遗传背景和与重要次生代谢产物积累相关的功能基因尚不明确，以往主要通过以大肠杆菌作为宿主细胞的原核表达和以酵母作为宿主细胞的真核表达的体外功能验证法，和以RNAi，VIGS过表达技术[2830]为主的体内功能验证法对基因的功能进行鉴定。然而上述3种体内功能验证法均是通过调控基因的表达量从而达到功能验证的目的，相较而言，CRISPR/Cas9技术从DNA水平上对基因进行编辑，可以从源头上阻止基因的完整表达，是体内验证基因功能强有力的工具。在植物研究领域，Christopher Brooks等[7]利用CRISPR/Cas9技术敲除了控制番茄叶片形态的SlAGO7基因，与野生型番茄宽阔平展的叶片相比，突变植株的叶片窄小甚至有些呈针状，从反向遗传学的角度证明了番茄SlAGO7基因的功能；Shan等[4]利用基因枪转化方法对水稻PDS和小麦MLO等基因实现了定点敲除，获得的纯合PDS基因敲除水稻突变体产生了矮化、白化的突变表型；地钱是研究陆生植物进化的模式植物，Sugano等[31]通过农杆菌共转化地钱壳孢子调控生长素正调控因子ARF1基因，经抗性筛选后在T1代中获得的突变植株对比野生型地钱显示出了明显的NAA抗性，而且这些突变可以通过无性生殖的方式实现稳定遗传。以上研究表明，CRISPR/Cas9技术已经成功在双子叶植物、单子叶植物和个别低等植物的研究中展开应用，并且能够很好地揭示基因功能，可以预见，该技术在药用植物功能基因研究方面具有巨大的应用潜力。

除了鉴定特定基因的功能以外，CRISPR/Cas9技术还可以与高通量测序结合进行功能基因组学研究。高通量测序技术可以在整个基因组、转录组或外显子组等范围内检测出基因或其转录产物的变化，筛选得到可能与某类功能相关的基因。在医学研究领域，Yuexin Z等[32]利用CRISPR/Cas9技术和高通量DNA测序技术建立了一种慢病毒聚焦型人源细胞文库，并开发出了一种基于sgRNA文库进行高通量功能基因筛查的新方法。这种研究思路同样适用于药用植物，如通过CRISPR/Cas9技术敲除某条代谢途径上的某个关键基因，将相应次生代谢产物积累发生显著变化的植株与野生型植株进行比较转录组学研究，分析差异基因，将为解析该代谢途径和深入挖掘途径上关键基因提供有效途径。

2.2 药用植物活性成分次生代谢及合成生物学研究 活性成分含量的积累一直是药用植物研究关注的重点，目前许多重要活性成分的获取仍然依赖于对原植物的提取，如果能够通过改造植株代谢网络达到使目标次生代谢物含量增加的目的，这将在一定程度上减少药用植物的采挖，促进资源的可持续发展。Keasling课题组利用CRISPR/Cas9技术对酿酒酵母工程菌进行了改造，通过提高MVA途径代谢流、降低甾醇代谢效率以及截断下游二萜类成分合成等方法，使突变菌株产生的甲羟戊酸含量比野生型菌株高出41倍[33]。按照这样的思路，利用CRISPR/Cas9技术可以对许多重要次生代谢产物的含量进行调控，例如敲除丹参酮生物合成旁路途径上的关键基因，使GGPP的代谢流向丹参酮类成分合成途径上转移等。

大肠杆菌和酿酒酵母等简单生物的遗传背景清楚、生长迅速、培养简单，是基因工程主要的受体菌，可以通过设计代谢途径和不同模块组成的生物元件来改变细胞的正常代谢，合成人们感兴趣的代谢物，比如中药药用活性成分。与其他药用活性成分的合成生物学研究相比，一些来源于药用植物的单体药物的生物合成受到了更广泛的关注[34]。近年来，中药活性成分的合成生物学研究取得了一定的成果，例如，伯克利分校Keasling课题组构建了高产青蒿酸的工程菌，与Amyris公司合作，使青蒿酸产量高达25 g・L-1，并经简单化学反应合成青蒿素[3536]；Dai等[37]获得了同时合成齐墩果酸、原人参二醇和原人参三醇的第一代“人参酵母”细胞工厂；Zhou等[38]通过“模块途径工程”策略在酿酒酵母中获得了高产的丹参酮类活性成分前体物质次丹参酮二烯。在异源生产过程中，工程菌的特性对产物的产量影响极大，由于药用活性成分的多样性，研究过程中往往要用到不同功能、不同特点的工程菌株，但传统的工程菌改造方法较为繁琐且耗时，并非每个实验人员都能轻松熟练地掌握，这在一定程度上给科研工作带来了不便。但新一代基因编辑技术CRISPR/Cas9诞生后，可以一次性对多个位点进行改造，操作过程简单、高效，具有分子生物学实验背景的研究者只需通过简单的学习便可掌握这一技术，由此可见，CRISPR/Cas9技术将为中药活性成分合成生物学的发展提供新方法。

2.3 药用植物的分子育种 在植物学研究领域，CRISPR/Cas9 技术可以实现定向育种，培育出高产、抗逆或一些有具有特殊应用价值的作物或菌种。与自然进化相比，通过基因编辑技术对控制植物关键性状的基因进行编辑能够大大加快选育良种的速度。传统的转基因技术只能将外源基因随机整合到植物基因组中，以此达到改造和培育新品种的目的，但在这个过程中，插入位点的随机性常常导致许多不利结果，如内源基因破坏、外源基因沉默等，因此，通过传统的转基因手段得到理想的转基因植株是一件耗时且繁杂的工作。然而，CRISPR/Cas9 技术可以实现基因组定点编辑，使植物的分子育种变得高效、定向。

Yanpeng W等[39]通过CRISPR/Cas9技术敲掉了六倍体植物小麦的TaMLO基因，获得了抗白粉病小麦新品种。尽管很多植物是异源多倍体，但CRISPR/Cas9系统可以同时编辑多条基因，因此该技术与其他基因编辑技术相比更简单高效。目前，运用于临床的中药材主要通过人工种植和野外采挖等方式获取，药用植物病虫害一直是药农的心腹大患，例如丹参的枯萎病、叶斑病，黄芩、当归、黄连的白粉病，人参、西洋参的水锈病等，是否可以学习农作物研究领域通过CRISPR/Cas9技术对某些药用植物病虫害开展基因防治值得思考。另一方面，一些药用植物在生长过程中会产生对人体有害的次生代谢产物，限制了其在临床中的应用，例如马兜铃科的关木通，由于代谢产生的马兜铃酸具有肾毒性，给许多长期服用龙胆泻肝丸的患者带来了肾功能损害。如果可以通过CRISPR/Cas9技术阻断相关有害成分的代谢通路，这也将是药用植物品种改良的一个新的研究策略。

自转基因植物问世30多年来，其生物安全性一直饱受争议。与传统的转基因技术不同，CRISPR/Cas9技术具有定点修饰功能，可以从后代中筛选出只有目标突变基因不含有Cas9蛋白和sgRNA表达载体的株系，这种突变株系不存在外源基因的污染，突变效果与植物自然发生的遗传变异无异，可大大提高人们对转基因植物的接受程度。Je Wook Woo等[40]通过将纯化过的Cas9蛋白和sgRNA分别导入拟南芥、烟草、莴苣和水稻的原生质体中，再将原生质体诱导成无外源基因插入的再生植株，突变效率高达46%。虽然药用植物的分子育种尚未开展，但随着基因编辑技术的不断完善和潜在危险性的不断降低，CRISPR/Cas9技术极有可能全面应用到药用植物的分子育种和品种改良研究中。

2.4 其他 CRISPR/Cas9系统除了用于简单高效的基因组定向编辑和基因组规模的功能筛选外，还可以用于内源基因的转录调控、表观遗传调控以及特定染色点的标记等。Cas9蛋白包含RuvC和 HNH 2个行使切割功能的结构域，二者分别负责切割一条DNA单链，若其中一个结构域发生突变，Cas9 将丧失双链切割功能而变成切口酶（nickase） ，即nCas9，只能切割双链DNA中的1条。nCas9与2条不同的sgRNA联用可大大提高基因编辑的特异性。因为只有2个sgRNA同时打靶时才能引起DSB，nCas9也可用于较大片段的置换，显著提高HDR的发生几率[41]。若同时突变RuvC和 HNH结构域，则Cas9成为dead Cas9（dCas9） ，内切酶活性丧失。dCas9能够在gRNA引导下定向结合到靶序列上，造成位阻效应阻碍RNA聚合酶复合体的结合，从而在不改变编码DNA序列的情况下抑制基因的转录，这就是CRISPR干扰（CRISPR interference，CRISPRi）[42]。传统的 RNAi 技术是对转录后的 mRNA 进行干扰，而CRISPRi能够在转录前期对基因的表达进行调控，通过靶向顺式作用原件、抑制反式作用因子结合的方式激活或抑制特定基因的表达，有助于基因启动子功能和其他基因调控模块的研究。Larson等[42]的研究表明CRISPRi对基因的转录调节具有非常高的特异性，表明CRISPRi在精确调节基因表达方面具有极大地潜力。此外，dCas9还可应用于生物表观遗传学研究中，可以定点添加或去除表观遗传标记，为研究表观遗传修饰在基因调控网络中的作用提供新的思路。在植物研究领域，诱导植株产生HDR一直是个难题，nCas9技术的产生也许可以帮助解决这个问题。同样，dCas9也有望用于药用植物的表观遗传研究中，以阐释药用植物的遗传背景和药材道地性。

3 讨论

相比分子生物学其他研究领域，药用植物分子研究的基础较为薄弱。近些年来，尽管在广大科研工作者的共同努力之下取得了较为丰硕的研究成果，但与模式植物和重要农作物烟草、拟南芥、水稻等的研究进展相比，药用植物的研究仍较落后。首先，药用植物遗传转化体系的建立不够完善，许多重要的药用植物由于难以建立起有效的遗传转化体系而无法开展转基因研究；目前转化体系建立的比较完善的药用植物只是凤毛麟角，如丹参等。其次，药用植物的基因组数据不够完整，绝大多数药用植物没有进行基因组测序，这使利用CRISPR/Cas9技术对药用植物基因组进行编辑存在一定的盲目性，无法估测其脱靶效率。但据报道，CRISPR/Cas9技术在植物中的脱靶效率较低，研究者们可以通过设计多个sgRNA靶向同一条基因，若不同突变位点出现的突变表型呈现一致性，即可证明基因的功能。此外，许多重要的次生代谢产物的生源合成途径尚不清晰，限制了该技术的进一步应用。最后，药用植物研究关注的重点大多是代谢途径上的关键基因，对其他细节方面，如启动子、增强子、抑制子的研究并不深入，药用植物的分子研究仍然存在一些盲区，这也在一定程度上限制了CRISPR/Cas9技术功能在药用植物研究中的充分发挥，如dCas9系统的靶向激活、抑制、表观修饰等功能。随着CRISPR/Cas9技术、药用植物分子生物学技术的发展和上述问题的解决，CRISPR/Cas9技术必将在药用植物研究领域中大放异彩。

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