白芷酒炖前后4种香豆素类成分的含量测定及相互转化机制研究

[摘要] 采用高效液相色谱法同时测定白芷酒炖前后氧化前胡素、水合氧化前胡素、白当归脑、白当归素的含量，并对氧化前胡素与水合氧化前胡素、白当归脑与白当归素的相互转化的机制进行研究。研究结果表明，白芷经酒炖后氧化前胡素、白当归脑含量降低，水合氧化前胡素、白当归素含量增加，其含量降低与增加的原因主要为白芷在黄酒的弱酸性及受热作用下，氧化前胡素、白当归脑会发生环氧化合物（醚键）的开环反应，分别生成水合氧化前胡素、白当归素。该研究将为白芷酒炖的炮制机制研究提供科学依据。

[关键词] 白芷； 酒炖； 氧化前胡素； 水合氧化前胡素； 白当归脑； 白当归素

白芷具有解表散寒，祛风止痛等功效，临床多用于感冒头痛等的治疗。白芷古代的炮制方法16种（去皮、水洗、去梢、微焙、炒炭、炒、湿纸裹煨、面裹煨、醋制、盐炙、酒炙、米泔水制、黄精制、斑蝥制、萝卜制、石灰制），目前《中国药典》一部、各省市炮制规范的白芷项下均收载生白芷，未见其他炮制品。但在2015年版《中国药典》一部收载的成方制剂“都梁丸”处方中，君药白芷采用酒炖（隔水蒸制）炮制后入药，该药由同仁堂生产，主要用于风寒瘀血阻滞脉络所致的头痛。白芷酒炙，在《滇南本草》的附方中有记载，依据附方的功效，推测酒洗、酒浸可增强白芷祛风散寒作用，酒炒可加强白芷消肿排脓作用[12]。都梁丸中白芷酒炖入药，是否具有“增效”的炮制意义，值得对其深入研究。白芷主要含有香豆素类化学成分，目前有研究通过虚拟筛选结合药效学实验，证明白芷中白当归素、水合氧化前胡素对硝酸甘油型偏头痛大鼠有明显的治疗作用，水合氧化前胡素具有解痉作用[34]，因此，本实验采用HPLC测定白芷酒炖前后氧化前胡素、水合氧化前胡素、白当归脑、白当归素含量，并对氧化前胡素与水合氧化前胡素、白当归脑与白当归素的相互转化的机制进行研究，为进一步深入研究酒白芷炖的炮制机制及其在都梁丸中炮制入药的临床应用目的提供科学依据。

1 材料

Agilent 1100高效液相色谱仪（chemistation system工作站），AR2140型1/1 万电子分析天平（上海奥豪斯公司），KQ3200超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

白芷3批（祁白芷）购于河北安国，经辽宁中医药大学李峰教授鉴定为伞形科植物白芷Angelica dahurica （Fisch.ex Hoffm.） Benth.et Hook.f.的干燥根；酒炖白芷3批（自制，黄酒加入量为20%，焖润时间为0.5 h，隔水蒸制时间为5 h，干燥，即得）；水合氧化前胡素（批号R25A6F2764）、氧化前胡素（批号R26A6S2757）、白当归脑（批号P01030SA13）、白当归素（批号P01028SA13）均购于上海源叶生物科技有限公司，HPLC检测纯度均≥98%；黄酒（批号20140928，镇江恒顺酒业有限责任公司）；乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 氧化前胡素、水合氧化前胡素、白当归脑、白当归素的含量测定

2.1.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温30 ℃，检测波长为254 nm。流动相乙腈（A）水（B），梯度洗脱（0～50 min，5%～65% A，50～70 min， 65%～95% A），流速1.0 mL・min-1[4]。供试品溶液、混合对照品溶液进样量均为10 μL。HPLC图见图1。

2.1.2 对照品溶液的制备 分别取水合氧化前胡素、白当归素、白当归脑、氧化前胡素对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1 mL含水合氧化前胡素0.68 mg、白当归素0.6 mg、白当归脑0.66 mg、氧化前胡素0.65 mg的对照品溶液备用。分别精密量取水合氧化前胡素、白当归素、白当归脑对照品溶液各1.0 mL及氧化前胡素对品溶液2.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液制备 分别取白芷、酒炖白芷粉末（过20目筛）约0.2 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率300 W，频率50 KHz）1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足失重，摇匀，滤过，分别取续滤液作为供试品溶液[1]。

2.1.4 线性关系考察 分别精密量取上述2.1.2项下的混合对照品溶液0.10，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密量取10 μL注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。结果见表1，各成分在相应的范围内，线性关系良好。

2.1.5 稳定性试验 分别精密吸取同一酒炖白芷供试品溶液10 μL，分别在0，2，4，6，8 h，测定峰面积并计算RSD，结果水合氧化前胡素、白当归素、白当归脑、氧化前胡素峰面积的RSD分别为1.3%，1.5%，1.8%，1.7%，表明8 h内供试品溶液稳定性良好。

2.1.6 精密度试验 取同一酒炖供试品溶液，在上述色谱条件下，连续进样6次，记录峰面积并计算RSD，结果水合氧化前胡素，白当归素、白当归脑、氧化前胡素峰面积的RSD分别为1.4%，1.3%，1.6%，1.6%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 重复性试验 取同一酒炖白芷饮片，按2.1.3项下实验方法分别制备6份供试品溶液，并依法测定计算含量及RSD，结果水合氧化前胡素、白当归素、白当归脑、氧化前胡素含量的RSD分别为1.4%，1.7%，1.9%，1.7%，表明该法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的酒炖白芷（氧化前胡素、水合氧化前胡素、白当归脑、白当归素质量分数分别为0.094%，0.111%，0.065%，0.135%）约0.1 g，平行6份，分别按样品含量加入水合氧化前胡素、氧化前胡素、白当归脑、白当归素对照品溶液适量，按2.2项下制备供试品溶液，测定含量，结果4种香豆素的平均回收率分别为97.93%，98.04%，97.81%，98.21%，RSD分别为1.1%，1.1%，1.5%，0.79%。

2.1.9 含量测定结果 精密称取3批生品及对应炮制后的3批酒炖白芷，分别按2.1.3项下方法制备供试品溶液，依法测定并计算各供试品中4个成分的含量，结果见表2。

2.2 氧化前胡素与水合氧化前胡素，白当归脑与白当归素的相互转化的机制研究

2.2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈甲醇水（25∶15∶40），流速1.0 mL・min-1；检测波长为254 nm；柱温30 ℃；对照品与供试品进样量10 μL。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 分别精密量取2.1.2项下的白当归脑、氧化前胡素、水合氧化前胡素对照品溶液各0.2 mL，白当归素对照品溶液0.4 mL置2 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密量取2.1.2项下的氧化前胡素、白当归脑对照品溶液各1.0 mL，置5 mL量瓶中加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得氧化前胡素、白当归脑混合对照品溶液。精密量取氧化前胡素、白当归脑混合对照品溶液1.0 mL，置蒸发皿中水浴加热2 h，残渣甲醇适量溶解，转移置2 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液1。另精密量取白当归脑、氧化前胡素混合对照品溶液1.0 mL，置蒸发皿中水浴加热1 h，残渣精密加入黄酒0.3 mL，静置30 min后，水浴加热1 h，残渣甲醇适量溶解，转移置2 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液2。

2.2.4 空白溶液的制备 精密量取甲醇溶液1.0 mL，置蒸发皿中水浴加热1 h，残渣精密加入黄酒0.3 mL，静置30 min后，水浴加热1 h，残渣甲醇适量溶解，转移置2 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，作为空白溶液。

2.2.5 样品测定 分别精密量取混合对照品溶液，供试品溶液1，供试品溶液2及空白溶液10 μL，按2.2.1项下的色谱条件，依法测定，色谱图见图2。由图2中供试品溶液2（C）可知，氧化前胡素、白当归脑在加入黄酒并加热后，发生了成分转化，分别生成了水合氧化前胡素、白当归素，而未加黄酒的供试品溶液1（B）未有转化的成分，空白溶液（黄酒）无干扰。

2.2.6 转化机制分析 黄酒国标pH是3.50～4.50，显弱酸性，主要由于黄酒中一般含有有机酸，维生素，氨基酸等，乙醇低于20%，而乙醇中羟基会解离出少量氢离子；此外，黄酒中的氨基酸，会电离出少量氢离子。经测定本实验多用pH 3.90，乙醇≥11.5%的黄酒，因此，在黄酒的弱酸性作用下，氧化前胡素、白当归脑会发生环氧化合物（醚键）的开环反应，分别生成水合氧化前胡素、白当归素。反应式见图3。

3 讨论

目前有关炮制对白芷化学成分的影响的报道主药侧重于生品加工方法的影响[56]，在酒炖等炮制方法对氧化前胡素、白当归脑、水合氧化前胡素、白当归素的影响及4种成分同时含量测定的研究鲜有报道[78]。本文在对白芷中4种香豆素类成分研究中发现，酒炖炮制后，水合氧化前胡素、白当归素含量增加，氧化前胡素、白当归脑含量降低，其含量降低与增加的原因主要为氧化前胡素，白当归脑在黄酒的弱酸性及受热作用下，发生环氧化合物（醚键）的开环反应，致使氧化前胡素部分转化成水合氧化前胡素，白当归脑部分转化成白当归素，且含量增加的成分具有一定的药效作用，因此单从成分转化角度看，“都梁丸”白芷采用酒炖后入药具有一定炮制意义，但能否增强药效，尚需结合药理作用进一步深入研究。

另有文献报道[9]，白芷在60～90 ℃的加热条件下，欧前胡素、异欧前胡素含量会增加，但本文在前期研究中发现，酒炖白芷虽然在隔水蒸制的过程中受热，但欧前胡素、异欧前胡素略有下降，可能与受热介质为水蒸汽，时间过程长及黄酒的加入有关。

[参考文献]

[1] 中国药典. 一部[S]. 2015： 105，1325.

[2] 金洁，金传山，吴德玲白芷炮制历史沿革及其炮制品的现代研究进展[J]. 安徽医药，2012，16（1）：1.

[3] 苟美玲，李玲，杨文虚，等.拟筛选白芷治疗硝酸甘油诱导的偏头痛的活性成分[J]. 中成药，2014，36（4）：789.

[4] 王梦月，贾敏如，马逾英，等.白芷中四种线型呋喃香豆素类成分药理作用研究[J]. 天然产物研究与开发，2010，12（22）： 485.

[5] 李卫敏，李洋，郑立红，等.不同炮制方法对白芷成分中欧前胡素含量的影响[J]. 北京中医药，2010，29（12）： 93.

[6] 刘培，陈京，周冰，等.不同干燥加工方法及其条件对杭白芷中香豆素及挥发油类化学成分的影响[J].中国中药杂志，2014，39（14）： 933.

[7] 史洋，雷云，许海玉，等.白芷中3 个主要活性成分含量测定及其质量评价研究[J]. 中国中药杂志，2015，40（5）：915.

[8] 邓瑞，张静，罗维早，等.RRLCUV同时测定川白芷中6种香豆素类成分的含量[J]. 中国中药杂志，2010，35（23）：3184.

[9] 李昌勤，彭琳娜，姚辰，等.加热处理对白芷中欧前胡素，异欧前胡素稳定性及酪氨酸酶活性的影响[J].中国中药杂志，2016，41（5）：845.