血清药理学方法在诱导肿瘤细胞凋亡降低酶活性研究中的应用

摘 要：目的：探讨血清药理学方法在诱导肿瘤细胞凋亡、降低酶活性等研究中的应用。方法：应用治疗肝癌、胃癌、肺癌、大肠癌等中药血清学方法，探讨其诱导肿瘤细胞凋亡、降低肿瘤细胞三磷酸腺苷酶（Mg2+―ATPase)与葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)酶活性作用。结果：①4种不同中药复方的中药血清，均能诱导相应肝癌细胞株、A549人肺癌细胞株、CCL-229人大肠癌细胞株和SGC-7901胃癌细胞株发生凋亡。②降低肿瘤细胞三磷酸腺苷酶与葡萄糖-6-磷酸酶活性。结论：血清药理学方法在诱导肿瘤细胞凋亡、降低酶活性等研究中的应用具有稳定性、可信性。

关键词：血清药理学；肿瘤；细胞凋亡； 三磷酸腺苷酶；葡萄糖-6-磷酸酶

中图分类号：R285.5文献标识码：A

文章编号：1673-7717(2008)05-1108-02

Research Application of Blood Serum Pharmacology Method on Induction of Tumor Cell Apoptosisand Lowering of Enzyme Activity

CAI Shuo1，LIU Shan2，ZHANG Lihong1, Jin Chunfeng1, Liu Chunying1

（Liaoning University of TCM,Shenyang 110032,Liaoning China；2.Fourth People's Hospital of Shenyang,Shenyang 110032,Liaoning,China）

Abstract：Objective:To explore the application of blood serum pharmacology method in the research of inducing cell apoptosis and reducing the enzyme activity. Methods:Using Chinese native medicine serology method of treating the liver cancer, stomach cancer, lung cancer, big cancer of theintestines to discuss the effect of inducing tumor cell apoptosis, reducing the enzyme activity of ATP (Mg2+ - ATPase) and the glucose -6-phosphatase (G-6-Pase) of tumor cell. Results:①Four kind of different compound Chinese medicical blood serum all can induce the cell apoptosis of corresponding liver cancer cell lines ,A549 human lung cancer cell lines, CCL229 human colorectal carcinoma cell lines and cell line SGC7901. ②The activity of ATP and Glucose -6- phosphatase in tumor cell is decreased .Conclusion:The research application of blood serum pharmacology method on the induction of tumor cell apoptosis and the lowering of enzyme activity has the stability and the credibility.

Keywords:blood serum pharmacology;tumor;cell apoptosis;Mg2+-ATPase;glucose-6-phosphatase

20世纪80年代中期，日本学者Iwama H等率先提出“血清药理学方法”。此法是先给动物灌胃给中药，一定时间后再采集、分离其血清，并用此含药血清进行体外实验[1]。血清药理学方法已被广泛用于中医药作用机制的研究，研究层面已涉及到细胞增殖、分化、凋亡与细胞周期的调节以及基因表达等方面。本研究采用治疗胃癌、肝癌、肺癌、大肠癌等中药血清学方法，深入探讨其诱导肿瘤细胞凋亡、降低肿瘤细胞三磷酸腺苷酶（Mg2+―ATPase)与葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)酶活性作用。

1 实验方法

1.1细胞培养主要试剂 抗肝癌、胃癌、肺癌、大肠癌等不同中药复方中的中药，均由辽宁中医药大学第一附属医院提供。

1.2中药制剂制备 将3个不同中药复方组成后传统煎制：中药清水浸泡2h，煮沸后文火煎15min，纱布过滤取汁，药渣加水再煎20min，两次药汁混合，浓缩为100%。

1.3药物血清制备 动物：SD大鼠由辽宁中医药大学实验动物中心提供。30只SD大鼠随即分为3组，即中药组10只，化疗组10只，对照组10只。实验前禁食12h，采用2次给药方法（第1次给药2h后重复等量给药1次），每100g大鼠灌胃中药制剂1mL，2次/日连续灌胃3天。化疗组、对照组生理盐水等量灌胃3天。分别在末次给药后1、2、3h采血，戊巴比妥钠麻醉，无菌条件下，下腔静脉取血，静置4h，4℃，3000r/min 20min离心，分离血清，同种条件药物血清混匀，过滤，56℃30min灭活，-20℃保存，备用。

血清分组：中药血清组（中药组）、化疗血清组（西药顺铂-DDP组）、对照血清组（对照组）。（1）中药血清组：临用前将中药组大鼠血清加入PRMI1640培养液，浓度分别为5%、10%、20%。（2）化疗血清组：用含10%化疗组大鼠血清PRMI1640培养液，DDP的终浓度为5%、10%、20%。（3）对照血清组：大鼠血清中加入PRMI1640培养液，终浓度为5%、10%、20%。

1.4细胞株 肝癌细胞株、SGC7901胃癌细胞株、细胞株 A549人肺癌细胞株和CCL229人大肠癌细胞株和均由中国医科大学生物教研室卫生部重点实验室提供。

2细胞培养

将细胞从冻存于液氮中的安瓶取出，放入37～40℃水浴中1min内融化，无菌条件下打开安瓶，接种于2只无菌培养瓶中。加入10%小牛血清PRMI1640培养液，在5%CO2，37℃条件下CO2培养箱中培养，倒置显微镜下动态观察细胞形态，24h后见细胞贴壁生长状态良好，弃培养液，分别加入各组血清，继续培养。

3标本制备

3.1细胞凋亡 生长在培养瓶内的贴壁细胞用2.5%戊二醛4℃原位固定2h，用橡皮铲刮下细胞，转至离心管内，低温高速离心机2000r/min，15min，琼脂处理成块，PBS冲洗，1%锷酸（OsO4）后固定1.5h，梯度乙醇、丙酮脱水，Epon812树脂包埋，超薄切片机（LKB-V）切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜（JEM-1200）观察、摄片。

3.2酶细胞化学 取出培养皿中的载片，PBS冲洗，2%多聚甲醛固定30min，8%蔗糖脱水，3次×30min，分别加入Mg2+-ATP酶和G-6-P酶孵育液，37℃孵育45min，双蒸水冲洗，2min×3次，2%硫化铵成色，2min，双蒸水冲洗，2min×3次，梯度乙醇脱水各10min，甘油明胶封片，普通光镜下观察、拍片。

4 结果

4.1 细胞凋亡 ①正常对照组：各组肿瘤细胞株多为长梭形，表面可见较多的微绒毛，线粒体、粗面内质网、高尔基复合体、溶酶体等细胞器丰富、排列规则。②中药组：细胞表为椭圆形、圆形。表面微绒毛明显减少、消失。胞浆浓缩，可见大小不等的空泡，泡内容物电子密度与机制相似。细胞核变小、不规则，染色质浓缩、边集，呈断裂状，部分线粒体肿胀、空泡化。可见到典型的凋亡小体：圆形，可见从凋亡细胞脱落。位于凋亡细胞一侧，表面有完整的细胞膜包裹，小体内可见染色质碎片及破碎的内质网、囊泡化的线粒体等结构。③化疗组：结果与中药组相似，可见典型的凋亡小体。

4.2 酶细胞化学 ①Mg2+-ATP酶：光镜下可见对照组细胞Mg2+-ATP酶主要定位在细胞膜内侧，黑色酶反应颗粒大小均匀，密度大，呈线状规则排列，酶活性强。与正常组比较，中药组、西药组细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低。提示酶活性明显下降。②G-6-P酶：光镜下可见对照组细胞的G-6-P酶主要定位在细胞质内，酶反应颗粒粗大，排列密集，呈融合状，酶活性强。与对照组比较，中药组、西药组细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低，西药组部分细胞为阴性。提示酶活性明显下降。 采用Tiger图像分析仪测定Mg2+-ATP酶和G-6-P酶阳性细胞平均光密度（AOD）值，与对照组相比，P＜0.01。

5 讨论

中药血清药理学方法是由日本学者于20世纪80年代首先提出来的。是给动物灌服中药一定时间后，取其血清进行实验的药理学研究方法。利用血清药理学方法，给大鼠灌服中药一定时间后，取出血清进行体外实验。能客观反映中药进入体内之后，经过消化、吸收、代谢等过程后发挥药效作用，中药血清药理学提示：中药复方诱导的肿瘤细胞株凋亡具有可靠性和可信性[2]。

本研究证实，4种不同中药复方的中药血清，均能诱导相应肝癌细胞株、A549人肺癌细胞株、CCL-229人大肠癌细胞株和SGC-7901胃癌细胞株发生凋亡，见到典型的形态学特征性指标――凋亡小体[3-4]。

Mg2+-ATP酶是质膜标志酶，主要定位于细胞膜内侧，此酶参与质膜上离子的主动转运，,维持细胞内K+和Na+浓度相对稳定状态,保持细胞膜内、外渗透压平衡以及参与保持细胞内外的化学梯度和跨膜电位，维持细胞内高钾低钠状态，从而保证细胞的活性。本实验中，药物血清作用后细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低，提示酶活性明显下降。G-6-P酶是内质网标志酶，是一种多功能酶,是细胞内糖原异生作用中重要酶之一，被称为“代谢标志酶”之一。此酶在糖代谢、免疫球蛋白合成及其它蛋白质合成、浓缩、加工等方面发挥重要作用。本实验中，药物血清作用后细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低，有的为阴性。提示酶活性明显下降[5-6]中药血清诱导肿瘤细胞凋亡，降低肿瘤细胞株酶活性可能是中药复方抗肿瘤的机理之一。笔者同样成功应用本中药血清药理学技术进行了胃癌宁对人SGC-7901胃癌细胞株p53、bcl-2基因表达影响的研究[7]。

（1）给药方案与采血时间。目前存在多种给药方案。但一般使用灌胃方式，也可通过皮肤、黏膜、呼吸道等途径给药。给药时间最短者为1天，最长者为10天；给药次数也各不相同，有每天2次的，也有每天3次的。尽管已有研究表明，连续用药5天和10天所制备的含药血清的生物学效应是相似的，但无论哪种给药方法都必须使药物浓度达到相对平衡状态。根据目前掌握的大量药物的有效成分的药代动力学数据，本实验采用与多数研究者一致的即时血清在实验前禁食12h，次日采用两次给药方式（一次给药后2h等量给药），连续灌胃3天，日两次；采血时相，分别在末次给药后1、2、3h采血。证明是研究中药复方作用肿瘤细胞株较为可靠的血清药理学方法血清[8-9]。（2）含药血清用量。目前中药含药血清的浓度还没有确切的规定，选用5 、10 和20浓度的含药血清进行实验所得结果的说法不一，进行细胞增殖抑制作用的实验采用高浓度的效果好，而进行细胞增殖促进作用的实验采用低浓度的效果好[10]，本研究采用10的平均浓度进行实验，结果较好。当然，最佳血清浓度是因不同实验而异的，故最好的做法是通过预实验来确定。血清药理学可较好地克服了中药粗制剂直接进入体外实验的缺点，其结果的可信度明显优于中药粗制剂直接用于体外实验，不仅提示中药制剂在胃肠内处理过程中活性成分的转化与改变，而且有利于中药真正有效活性部位、有效成分的发现，将有助于促进中药药理现代化的发展，为新药开发奠定能基础。本研究进一步证实，血清药理学方法在诱导肿瘤细胞凋亡、降低酶活性等研究中的应用具有稳定性、可信性。血清药理学方法的应用将更多的相关中药方剂引入抗肿瘤细胞凋亡及诱导细胞凋亡方面的研究，筛选有效的中药成分与其有效组方来达到诱导大量肿瘤细胞凋亡，揭示中药的抗癌机理，为中药治疗肿瘤提供科学、客观和现代的手段与方法，是今后研究的重要内容，对人类攻克肿瘤有着重大意义。

参考文献

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