产D―乳酸菊糖芽孢乳杆菌的诱变及发酵条件研究

摘要：以菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）为出发菌株，经紫外线、硫酸二乙酯的诱变处理，采用碳酸钙平板初筛及摇瓶复筛得到1株高产D-乳酸的正向突变株D11。通过单因素试验研究D11菌株发酵产D-乳酸的条件。结果表明，当发酵温度37 ℃，初始pH 6.5，转速160 r/min，接种量5%，装液量50 mL/250 mL，发酵68 h，该菌株D-乳酸产量达到56.18 g/L，比出发菌种提高49.53%。

关键词： 菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）;D-乳酸;诱变育种;正向突变

中图分类号：Q935 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）20-4936-05

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2014.20.043

Mutation Breeding and Optimization of Fermentation for Producing D-lactic Acid

with Sporolactobacillus inulinus

LIU Lian-jie， ZHOU An-sheng， FANG Cong-ming， WANG Chang-gao， LIN Jian-guo， DU Xin， CAI Jun

（Key Laboratory of Fermentation Engineering of Ministry of Education/Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， China）

Abstract： After the original strain Sporolactiobacillus inulinus was mutated by UV and DES and selected by CaCO3 plates， a D-lactic acid yield positive mutant D11 by fermenting in shake flask was obtained. Through the single factor experiment， the fermentation conditions of producing D-lactic acid was studied. The results showed that the D-lactic acid production reached 56.18g/L when the fermentation temperature was 37 ℃，initial pH was 6.5， the rotation speed was 160 rpm/min， inoculums was 5%（V/V）， liquid volume was 50 mL/250 mL， fermentation time 68 h. The D-lactic acid production reached 56.18 g/L and was enhanced by 49.53% compared with original strain.

Key words： Sporolactobacillus inulinus; D-lactic acid; mutation breeding; forward mutation

乳酸是自然界最小的手性分子，具有L（+）和D（-）两种光学构型。D-乳酸作为一个手性中心，是合成多种手性物质的前体，在医药、农药、化工等方面的应用十分广泛。与L-乳酸繁荣的研究景象相比，D-乳酸的开发略显单薄[1]。异构体之一的D-乳酸是一种重要的手性中间体和生物可降解聚乳酸材料合成的原料。近年来石油资源的日益减少以及人们环保意识的提高，极大地促进了通过发酵法合成D-乳酸的需求量，同时要求对其生产菌种的发酵性能进行改造。研究者们利用诱变育种策略显著提高了乳酸菌的D-乳酸产量[2]。

微生物诱变育种技术可选育出产量高、性状优良的突变株。通过发酵条件优化可确定微生物高效合成产物的最适环境[3]。目前，通过诱变选育获得高产D-乳酸的工作已有一些报道，如：用甲基磺酸乙酯（EMS）对野生型Lactobacillus delbrueckii ATCC 9649 菌株进行诱变，突变菌株DP3利用复杂培养基乳酸产量可达117 g/L，比出发菌种提高了75%，且具有更高的乳酸耐受能力、生长速率和转化率[4，5]。用氮离子束对芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus）进行诱变，突变菌株Y2-8的D-乳酸产量达122 g/L，比出发菌株提高了2倍。于培星[6]以凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）JD-063D为出发菌株，采用紫外线、硫酸二乙酯、钴60γ-射线辐照、微波进行复合诱变，得到正突变菌株，进行发酵检测和遗传稳定性试验，最终筛选出一株JD-76D，该菌株产酸由出发茵株的61 g/L提高到145 g/L，D-乳酸纯度由原菌株的97.5%增加到98.7%以上。

本试验以紫外线和硫酸二乙酯诱变处理的方法，对菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）的选育及诱变后的最适发酵条件（发酵时间、发酵温度、初始pH、摇床转速、接种量、装液量等）进行了研究。

1 材料与方法

1.1 菌种

菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus），本实验室保藏。

1.2 培养基和培养方法

斜面培养基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母抽提物0.5%，葡萄糖2%，柠檬酸铵0.2%，磷酸氢二钾0.2%，乙酸钠0.5%，吐温80 0.1%，硫酸镁0.02%，硫酸锰0.005%， 琼脂2%，115 ℃灭菌30 min，pH 6.2～6.5。

种子培养基（液体MRS）：蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母抽提物0.5%，葡萄糖 2%，柠檬酸铵0.2%，磷酸氢二钾0.2%，乙酸钠0.5%，吐温80 0.1%，硫酸镁0.02%，硫酸锰0.005%，115 ℃灭菌30 min，pH 6.2～6.5。

发酵培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，酵母抽提物0.5%，葡萄糖10%，磷酸氢二钾0.2%，乙酸钠0.3%，硫酸镁0.01%，发酵前一次性添加碳酸钙5%，115 ℃灭菌30 min，pH 6.5。

碳酸钙初筛平板培养基：在上述斜面培养基基础上加入碳酸钙5%。

1.3 诱变方法

1.3.1 细胞悬浮液的制备 取活化后的斜面菌种一环，接入50 mL种子培养基，37 ℃摇床培养24 h后，取10 mL转入100 mL种子培养基中，37 ℃摇床培养至对数生长期，取10 mL该培养液，8 000 r/min离心10 min，收集菌体，菌体用10 mL生理盐水离心洗涤2次，用玻璃珠振荡分散，然后将菌体充分悬浮于10 mL生理盐水中。使细胞浓度为l08 个/mL，细胞悬浮液的浓度采用平板计数法测定。

1.3.2 紫外线处理 紫外致死率曲线的制作：分别取1 mL菌悬液于无菌培养皿中，置于紫外灯下30 cm处，开启15 W紫外灯，预热20 min，在磁力搅拌下，打开皿盖，分别照射0、5、10、15、20、25、30、35、40、45 s，然后取不同时间诱变处理的0.5 mL菌液进行适当稀释后，涂布于碳酸钙初筛平板上，37 ℃避光培养48 h，计算每皿菌落数。计算致死率并绘制曲线。

致死率=（A-B）/A×100%（A为对照组平皿上的菌落数，B为不同时间诱变处理后平皿上的菌落数）

选择致死率为70%～80%的处理时间作为最佳诱变时间[7]，并在此时间下进行紫外线诱变处理。

1.3.3 硫酸二乙酯（DES）诱变 取硫酸二乙酯原液5 mL，加入到5 mL无水乙醇摇匀溶解，将经紫外诱变得到的诱变菌株制备菌悬液与硫酸二乙酯溶液混匀，自加入硫酸二乙酯溶液后开始计时，在37 ℃、160 r/min的摇床内振荡反应，处理一定时间后加入硫代硫酸钠溶液终止反应，并涂布于碳酸钙初筛平板上，37 ℃避光培养48 h，计算每皿的菌落数。计算致死率（计算方法同紫外诱变）并绘制曲线。

1.4 诱变菌株的筛选

1.4.1 初筛 将经过诱变处理的菌液涂布于碳酸钙初筛平板上，37 ℃避光培养48 h后，观察变色圈的大小，测定变色圈直径和菌落直径之比（即HC值），挑选HC值大的菌株保藏。

1.4.2 复筛

1）种子液制备。取初筛获得的菌株一环接入50 mL种子培养基，37 ℃摇床培养24 h后，取10 mL转入100 mL种子培养基，37 ℃摇床培养24 h即得。

2）发酵复筛。将上述种子液以5%的接种量转入装有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶，37 ℃摇床发酵培养72 h，测定其D-乳酸含量，选取产量高的菌株保存。

3）遗传稳定性试验。选取诱变后得到D-乳酸含量较高的变异菌株连续传代7次，测定D-乳酸含量。

1.5 分析方法

1.5.1 D-乳酸含量的测定 采用高效液相色谱法，色谱分离柱：Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）; 检测器：紫外检测器;波长：210 nm;流速：0.5 mL/min;柱温：35 ℃;流动相：0.2 mmol的硫酸铜。

1.5.2 总酸含量的测定 采用EDTA定钙滴定法[8]。

2 结果与分析

2.1 出发菌株生长曲线

出发菌株菊糖芽孢乳杆菌在MRS液体培养基中，37 ℃摇床培养的生长曲线见图1。从图1可看出，该菌株的对数生长期为16～28 h，根据此对数生长期，选取培养时间为24 h的细胞作为诱变用细胞。

2.2 菊糖芽孢乳杆菌的诱变

2.2.1 紫外线处理对出发菌株存活的影响 紫外线对出发菌株的诱变致死曲线见图2。从图2可知，随着紫外线照射时间延长，菊糖芽孢乳杆菌的致死率逐渐升高，有研究表明，较低剂量容易出现正突变，一般选择致死率为70%～80%的剂量。从紫外线致死曲线可看出，当照射时间为20 s时致死率达到80.7%。因此选择20 s作为紫外诱变的最佳诱变时间。

2.2.2 紫外线诱变突变株的筛选

1）紫外诱变突变株的平板初筛。对L0紫外线诱变后，挑取单菌落，测定HC值，并进行编号，结果见表1。由表1可看出，在挑选的16株单菌落中有8株的HC值比出发菌株L0大。选择这8株突变株进行发酵复筛。

2）紫外诱变突变株的发酵复筛。对HC值比出发菌株L0大的8株突变株进行发酵培养，由表2可以看出，U6、U8、U9的D-乳酸产量高于L0，而其他菌种的D-乳酸产量低于L0，说明仅有U6、U8、U9菌株发生了正向突变，其他菌种则发生了负向突变，所以对U6、U8、U9菌株进行稳定性试验。

3）紫外诱变突变株的稳定性试验。分别对这3株菌进行发酵传代试验，每株菌传代7次，从表3中可以看出，3株菌的遗传稳定性均较好，但是U6的乳酸产量最高，所以选择U6紫外诱变菌株进行下一步试验。

2.2.3 硫酸二乙酯（DES）诱变突变株的选育结果

1）硫酸二乙酯诱变致死曲线的绘制。DES对紫外诱变菌株U6的诱变致死曲线见图3。从图3可知，随着DES作用时间的延长，U6菌株的致死率逐渐升高。从DES致死曲线可看出，当处理时间为25 min时致死率大约为80%。因此选择25 min作为硫酸二乙酯诱变的最佳诱变时间。

2）DES诱变突变株的平板初筛。对U6菌株进行DES诱变后，挑取单菌落，测定HC值，并进行编号，结果见表4。由表4可看出，在挑选的13株单菌落中有7株的HC值比出发菌株U6大，所以选择这7株突变株进行发酵复筛。

3）硫酸二乙酯诱变突变株的发酵复筛。对HC值比出发菌株U6大的7株突变株进行发酵培养，结果见表5。经反复试验，D1、D5、D10和D11的D-乳酸产量均高于U6。所以选用这4株诱变菌株进行第二轮摇瓶发酵复筛试验。

4）DES诱变突变株的遗传稳定性试验。分别将这4株菌连续传代7次，每代分别进行发酵测定D-乳酸产量，结果见表6。从表6中可以看出，4株菌的遗传稳定性均较好，但是D11诱变菌株的乳酸产量最高，而且每一代的乳酸产量变化不大，故选择突变株D11为目标菌株。

2.3 对诱变菌株发酵条件的研究

在得到一株遗传稳定性好的菌株后，需要对其发酵条件进行研究。试验就其发酵时间、发酵温度、初始pH、转速、接种量和装液量进行了单因素试验验（图4）。从图4中可以得出，在发酵时间为68 h，发酵温度为37 ℃，初始pH为6.5，转速为160 r/min，接种量为5%，装液量为50 mL/250 mL是该紫外、硫酸二乙酯诱变菌株的最佳诱变条件。

在最佳发酵条件下，对该菌株进行验证发酵试验，D-乳酸的产量达到56.18 g/L，表明此发酵条件的可行。

3 小结与讨论

通过对L0进行紫外线和硫酸二乙酯的诱变，碳酸钙平板初筛及摇瓶发酵复筛，从大量突变株中筛选得到一株D-乳酸变异菌株D11，其D-乳酸的产量从最初的37.57 g/L提高到50.84 g/L，提高了35.32%。连续传代7次，D-乳酸产量变化不大，说明该突变菌株具有较好的遗传稳定性，之后又通过对发酵条件的单因素试验，结果表明在发酵时间为68 h，发酵温度为37 ℃，初始pH为6.5，转速为160 r/min，接种量为5%，装液量为50 mL/250 mL时，该诱变菌株的D-乳酸产量达到了56.18 g/L，比出发菌种提高了49.53%。与付卫明[9]、李小平等[10]的研究结果相比，本试验的发酵时间明显缩短，紫外照射时间明显减少，但是D-乳酸产量仍然较高，且与出发菌株相比，D-乳酸的产量增高明显。而且此诱变条件操作简单，容易达到，成本节约，也为该菌的工业化生产D-乳酸奠定了一定的基础。

参考文献：

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[9] 付卫明.D-乳酸高产菌株的诱变选育及其发酵条件的优化[D].天津：天津大学，2003.

[10] 李小平，魏玲玲，张慧发，等.保加利亚乳杆菌乳酸高产菌株的紫外诱变选育[J].山西农业大学学报（自然科学版），2010，30（1）：88-90.