22种化合物对幽门螺杆菌体外抗菌活性的研究

摘要：目的 筛检22种化合物对幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）标准菌株、临床耐药菌株的最低抑菌浓度（MIC），对临床化合物成药提供实验室依据。方法 采用琼脂稀释法检测22种化合物对Hp标准菌株（ATCC700392，NCTC11637）和临床耐药菌株（耐阿莫西林1 μg/mL，耐甲硝唑64 μg/mL，耐克拉霉素0.25 μg/mL）的MIC值。结果 化合物W9、J2、J5、J1O对5株Hp的MIC值均>32 μg/mL，化合物J11的MIC值为32 μg/mL，化合物J3、J4、J6、J7-J9的MIC值均为16 μg/mL，化合物W8的MIC值为8 μg/mL，化合物W5-W7、W10、W11的MIC值均为4 μg/mL，化合物GM1'、GM2'、GM3'的MIC值均为0.5 μg/mL，化合物GM1的MIC值为0.125 μg/mL。结论 GM1对Hp的抗菌活性最好，MIC值为0.125 μg/mL；抗菌活性次之的化合物是GM1'、GM2'、GM3'，MIC值为0.5 μg/mL；其余化合物对Hp均有不同程度的抗菌活性。

关键词：幽门螺杆菌；化合物；抗菌活性

幽门螺杆菌是一种定植于胃黏膜表面与黏膜层之间的革兰氏阴性微需氧菌，在正常人群中的感染率极高，以每年0.5%～1%的速度递增[1]，我国Hp的感染率已高达42%～90%，是Hp的高感染区之一[2]，大量研究显示Hp不仅与人类慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃淋巴样组织淋巴瘤等消化系统疾病相关[3-5]。国际上目前推荐一线治疗方案是同时服用质子泵抑制剂加两种抗生素的三联疗法[6]。但Hp对抗生素的耐药率不断上升[7]。为探索治疗Hp的新药，本次实验应用化学药物结构改造后形成的22种化合物，采用琼脂稀释法测定Hp标准株、临床耐药株的MIC值，为临床化合物成药提供实验室依据。

1资料与方法

1.1一般资料

1.1.1菌株来源 HpNCTC11637由贵阳医学院分子生物学实验室周建奖教授惠赠。HpATCC700392购置于ATCC；临床耐阿莫西林株、耐甲硝唑株、耐克拉霉素株由贵阳医学院临床检验教研室提供。

1.1.2化合物 22种化合物由浙江丽水学院药物研究所汪冶博士提供。一类化合物以3-氨基-N-甲基苯甲酰胺原料，经酰胺化反应合成了N-（3-甲基氨基甲酰基苯基）-芳香乙酰胺类化合物，编号为W5-W11；第二类化合物以间溴苯胺为原料，经酰胺化反应合成了N-间溴苯基-芳香乙酰胺类化合物，编号为J1-J11；第三类化合物分别以萘乙酸、吲哚乙酸、扁桃酸为原料，经酰胺化反应合成了3-氨基-N-甲基苯甲酰胺类化合物，编号为GM1、GM1'、GM2'、GM3'。

1.2方法

1.2.1配制传代平板及细菌培养 称取哥伦比亚血琼脂粉加双蒸水，高压灭菌后，待琼脂冷却至50℃～55℃时加入10%无菌脱纤维羊血、1%混合抗生素充分混充，倾倒于无菌平皿中，冷却后4℃备用。复苏待测的5株菌株，稳定培养观察细菌生长情况并对Hp鉴定：革兰氏染色、氧化酶、触酶、尿素酶试验。将革兰氏染色为阴性，生化鉴定试验均为阳性的细菌传代培养。

1.2.2配制含药平板 首先配制溶剂对照平板：取DMSO含量分别为0.5、1、1.5、2 mL的溶剂对照平板，经观察得出，在DMOS含量为1 mL时5种菌均生长良好，因此得出溶解化合物的DMSO量为1 mL。根据化合物的量配制化合物浓度梯度分别为32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL、0.125 μg/mL。

1.2.3药敏实验 将ATCC700392、NCTC11637、耐阿莫西林株、耐甲硝唑株、耐克拉霉素株分别制备菌悬液，将其涂布于含不同浓度的药平板上，三气培养箱内37℃培养72 h后，肉眼观察结果。

1.2.4 MIC判断 将平板置于暗色、无反光物体表面肉眼观察，在含22种化合物琼脂平板上肉眼看不到细菌生长对应的药液最低浓度为其MIC值。

2结果

3讨论

幽门螺杆菌治疗研究中还存在诸问题，目前要根除Hp仍很困难，根除失败的主要原因是对抗生素产生的耐药性。目前三联或四联疗法是最常用的方案，但联合的抗生素越多，副作用发生的频率越高，经费开支也越大。目前的研究表明[8]：Hp对常用抗生素的耐药率正逐渐上升，其中对甲硝唑的耐药率是导致根除失败的重要原因。

随着科学技术的发展，对于新药合成或对已知化合物结构进行改造得到新的药物的研究越来越全面，抗生素的药理作用已远远超出最初的作用。目前合成新药的设计主要是两方面，①是根据已知药物，进行化学结构改造；②是从生化作用的机制出发，合成崭新的类型。已知药物的结构改造正在不断导致作用优越的新药。尤其是要真正符合安全、绿色和高效的现代化学合成的理念。

在本次实验中采用22种化合物对Hp的MIC值进行筛检，不仅选用了两株Hp的标准株作为互相对照，还选用了三株临床耐药株（耐阿莫西林1 μg/mL，耐甲硝唑64 μg/mL，耐克拉霉素0.25 μg/mL）。实验采用的方法为琼脂稀释法结果表明：GM1对Hp的MIC值最小，为0.125 μg/mL，其抑菌效果最为明显；其次该系列的化合物GM1'、GM2'、GM3'对Hp的MIC值为0.5 μg/ml，说明该化合物对Hp的抑菌效果也很明显。由于阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素是治疗Hp感染的一线常用药物，因此本次实验所选取的这三株临床耐药株对22种化合物的筛检更有重要的临床意义，其结果对今后这22种化合物的成药提供了坚实的理论依据。

参考文献：

[1]刘巍，姜黎，胡兴寿，等.幽门螺杆菌相关性疾病及其防治[J].中国全科医学，2007，189（10）：1563-1565.

[2]胡伏莲.幽门螺杆菌感染诊疗指南[J].北京：人民卫生出版社，2006.

[3]Marshall BJ，Warren JR，Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration [J].The Lancet ，1984，1（16）：1311-1315.

[4]Correa P. Helicobacter pylori infection and Gastric cancer [J].Cancer epidemiol bimarkers prevention.2003，12：129-137.

[5]Peek RM Jr，Blaser MJ. Helicobacter pylori and gastrointestinal tract adenocarcinomas [J] . Nat Rev Cancer， 2002，2：28-37.

[6]Chuah SK， Tsay FW， Hsu PI et al. A new look at anti-Helicobacter pylori therapy [J]. World Journal of Gastroenterology，2011，17（35）：3971-3975.

[7]成虹，胡伏莲，谢勇，等.中国幽门螺杆菌耐药状况以及对耐药对治疗的影响--全国多中心临床研究[J].胃肠病学，2007，12（9）：525-530.

[8]胡伏莲.幽门螺杆菌感染治疗中的问题及处理策略[J].中国中西医志，2010，30（3）：229-232.