实验性肺气虚对大鼠肾组织AQP2的表达影响

摘要：目的：观察肺气虚模型大鼠肾组织AQP2表达的影响，以及血浆中内皮素(endotlin，ET)水平的变化。方法：大鼠20只随机分为模型组和对照组，应用放射免疫方法测定血中ET含量；应用Western blot方法测定AQP2蛋白含量的变化。结果：肺气虚模型组肾组织AQP1表达高于正常组；模型组血浆ET明显升高，与对照组比较，差异性显著(P＜0.05)。结论：肺气虚模型大鼠肾组织AQP2表达增强，内皮素可能促进肾组织AQP2表达。本实验结果为中医学肺肾相关理论提供了实验依据。

关键词：肺气虚；水通道蛋白2；内皮素

中图分类号：R－33　文献标识码：A　文章编号：1673－7717(2007)09－1846－03

水通道蛋白(aquaponins，water channels，AQPs)是多种组织细胞膜上存在的转运水的特异性孔道。它们的发现在分子水平上揭示了水跨膜转运调节的基本机制。在哺乳动物，目前至少发现11种具组织特异性分布的AQPs，其中AQP2、AQP3、AQP4等在肾脏的表达与尿的浓缩和稀释过程有密切关系，并在某些肾脏疾病及病理过程的发生中起了关键作用。

中医学理论认为“肾主水，肺为水之上源”。肺肾两脏相互配合，共同维持体内水液代谢的平衡。人们对水通道的研究还仅限于其生理作用及调节机制方面，关于肺气虚模型大鼠肾AQP2的变化及机制尚无报道。本文利用分子生物学手段研究了肺气虚模型大鼠肾AQP2表达的变化。

1　材料与方法

1．1　实验动物与分组　健康Wistar大鼠20只，由辽宁中医药大学实验动物中心提供，雌雄不拘，重量为(225±25)g。随机分为对照组和模型组，每组10只。

1．2　主要试剂及药物脂多糖(LPS)由美国Sigma公司提供，AQP2抗体由武汉博士德公司提供，ET放射免疫试剂盒．由北京北方生物技术研究所提供。

1．3　模型制作　模型组：参考慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的造模方法建立肺气虚证模型方法，于模型制作的第1、14天用10％水合氯醛腹腔麻醉大鼠后。切开颈部皮肤，分离肌肉，暴露气管，用1mL注射器气管内注入脂多糖(LPS)200μg/200μL，在皮肤伤口局部滴入庆大霉素注射液，然后缝合皮肤并用碘伏消毒。第2－13天、15－28天，置于1m3的烟室中。用力士牌香烟(焦油量为15mg，烟气烟碱量为1.3mg)点燃烟熏，每日烟熏30min，自由进食、饮水。对照组：将每只大鼠于第1、14天用10％水合氯醛腹腔麻醉后暴露气管，用1mL注射器气管内注入0.9％氯化钠注射液200μL，在皮肤伤口局部滴入庆大霉素注射液，然后缝合皮肤并用碘伏无菌操作，第2－13天、15－28天，置于无烟熏同样环境中饲养，自由进食、饮水。

1．4　检测方法　动物造模28天后用10％水合氯醛麻醉后，从大鼠腹主动脉取血5mL混匀，采用放射免疫分析技术，测定血清中ET的含量，由中国医科大学核医学室完成；取肺、肾组织，采用Western blot方法检测AQP2蛋白：组织以1:5比例加入裂解缓冲液，匀浆机匀浆，4℃12000r/min离心1h，上清为膜蛋白。采用酚试剂法进行样品(蛋白)浓度的定量，把样品调成相同浓度，加入buffer，沸水煮5min，上样、电泳、转印、加抗体孵育、染色，然后扫描成图。

1．5　统计学处理　采用SPSS10.0统计软件分析，实验数据均采用x±s表示，组间比较采用t检验。

2　结　果

2．1　肺气虚造模对大鼠行为及体征影响　经过2个月造模饲养，模型组大鼠先后出现咳嗽、气急、喘鸣、精神萎靡、行动迟缓、蜷伏不动、消瘦便溏、毛发蜷曲、舌色发青等体征；对照组则无异常改变。

2．2　肺气虚造模对大鼠肾组织AQP2蛋白Western blot印迹的影响取肾脏皮髓交界处组织进行蛋白测定，前3条泳道为正常对照组，后3条泳道为肺气虚模型组，结果显示肺气虚模型组肾组织AQP2表达高于正常组。

2．3　肺气虚造模对大鼠血中ET水平的影响　在进行肺气虚造模大鼠肾、肺组织AQP2蛋白Westem blot印迹的表达同时，所测定的血中ET结果显示，模型组血中ET明显升高，与对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)。

3　讨　论

中医学理论认为机体水盐代谢主要与肺脾肾三脏关系最为密切，在水液代谢过程中，肺主行水，肾主水液，相互为用，以肾为本，以肺为标。肺肾两脏相互配合，共同维持体内水液代谢的平衡。如果在病理状态下，肺失宣降，通调水道失职，必累及于肾，而致尿少，甚则水肿。肾阳不足，关门不利，则水泛为肿，甚则上为喘呼，咳逆倚息而不得平卧。即如《素问・水热穴论》所说：“其本在肾，其末在肺，皆积水也。”肺肾二脏之阴液相互资生。若其中之一受损，必会影响另一方面。

现代医学肾脏的泌尿功能属于中医学“肾主水”功能范畴，但是迄今从中医学肺主通调水道与肾主水液、肺肾相关理论去探讨肾脏水通道蛋白表达变化的报告未见报道。

90年代初对第一个水通道蛋白分子结构和功能的鉴定标志着对液体跨膜和跨细胞转运机制的重新认识。大量实验证明，水通道在维持机体的水平衡中起着重要的作用，且与水平衡紊乱所造成的某些疾病有密切的关系。AQP2位于肾脏集合管主细胞管腔侧和胞内囊泡内，是一种对抗利尿激素敏感的水通道。锂剂可以抑制它的表达，于是可以解释锂剂的毒副作用；在肾浓缩机制中起作用，在加压素(AVP)作用下通过两条途径调节集合管对水的通透性。首先加压素对含有AQP2的载体从细胞内向管腔膜转运有影响，使集合管主细胞膜AQP2数量在短时间内迅速增加，主细胞膜对水的通透性增大。其次，加压素可长期刺激主细胞的AQP2合成，从而增大主细胞的转运能力。这两种调控机制的异常与中枢性尿崩症、先天性尿崩症、继发性尿崩症、抗利尿激素异常分泌综合征等有关。

AQP2表达增高，有利于该部位对水的重吸收，尿液生成可以减少，疾病状态下可以导致液体在体内潴留。本实验结果利用western杂交技术证明显示肺气虚模型大鼠肾脏AQP2蛋白表达增加，说明在病理状态下，肺失宣降，通调水道失职，累及于肾，为肺肾相关理论提供了一个较好的证明。

ET是由血管内皮细胞合成、作用持久、且能引起血管强烈收缩的活性多肽物质，由内皮细胞合成分泌，肺不仅是富含ET的器官，还是ET清除和代谢的主要器官。缺血、低氧和高碳酸血症，均可刺激ET的释放。为此，不难推测，ET同样与中医肺气虚证的病理生理改变之间存在着一定的联系。有资料表明，大鼠血浆ET含量随肺气虚证逐渐形成而呈上升趋势，说明大鼠血浆ET的含量可作为肺气虚证重要的客观指标之一。本实验结果表明，模型组与对照组比较，血浆中ET含量明显升高(P＜0.01)符合该结论。经过大量的实验研究，有关ET发挥生物效应的机制已基本清楚。ET与ETR的结合物结合，首先激活磷脂酶C(PLC)，水解磷脂酰肌醇，形成1、4、5－三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DAG)。IP3引起肌浆网储存的钙释放，通过二氢吡啶敏感的电压通道，促进钙离子从细胞外进入细胞内，使得细胞内总的游离钙浓度增加。细胞内的钙含量增高可引起钙调蛋白的活化及神经介质的释放，并激活有关的酶类，包括肌球蛋白轻链激酶，导致细胞DAG的持续释放，促使对蛋白激酶C(PKC)的激活作用延长，进一步引起各种蛋白质的磷酸化及某些蛋白质的激活或失活，并调控部分基因的表达。有报道用ET受体A拮抗剂治疗后AQP4、AQP5表达明显上调，提示了ET具有对AQP6调控的可能。

本实验结果表明，模型组与对照组比较，在肺气虚证时ET含量明显升高的同时肾脏AQP1蛋白表达增加，其机制可能是通过这一途径来调节肾脏AQP2蛋白的表达。