CGRP对多梗死大鼠海马CA4区NPY细胞影响的研究

【摘要】 目的 探讨CGRP对MCI的影响。方法 选用Wistar大鼠,应用微栓子栓塞阻断法建立多发性脑梗死性缺血模型,借用ABC免疫组织化学染色方法、透射电镜技术并结合显微图像分析观察大鼠海马CA4区神经元的NPY变化。结果 治疗组NPY阳性反应物平均灰度值与MCI组比较低(P

【关键词】 CGRP;多发性脑梗死;海马;神经肽Y;大鼠

The alteration of CGRP of hippocampusin rats with multiple cerebral in farction

ZHOU Li-nan,ZHANG Ye,ZHANG Hui.

Department of Anaomy, Occupational and Technological School, Liaoning Traditional Chinese Medical College,Shen Yang 110101,China

【Abstract】 Objective To investigate the relationship between changes of NPY and MCI. Methods The alteration of NPY and ultrastructure of hippocampus CA4 neurous were studied by means of immunohistochemical ABC method transmission electron microscopy and quantitative method of micro-image analysis system were observed MCI on the wistar rats.Results The average grey value of NPY positive reactive product in experimental group was lower than that of MCI group(P

【Key words】 CGRP;Multiple cerebal infarction;Hippocampus;Neuropeptide Y;rat

作者单位:110101辽宁中医学院职业技术学院形态学教研室

我国是脑血管疾病发病率较高的国家,近年来,随着人民的物质生活水平的不断提高,老龄化人口的增加,发病率近期呈迅速上升趋势。脑血管疾病以高发病,高致残,高死亡而严重影响人类健康。并且多发性脑梗死(Multiple Cerebral Infarction,MCI)的发病率占有相当大的比重。迄今为止,MCI的发病机制不完全清楚,尚无十分有效的治疗,因此,研究其发病机制、防治措施具有重要意义。

海马的功能重要且复杂,它不仅参与学习记忆[1],还参与许多机能的整合作用。现已公认,在各种病理条件下如癫痫发作、循环受阻及CO中毒等,首先在脑内是海马受到损伤,因此表现出了海马易损性。Scharrer等认为,许多疾病只要影响血供,海马内的神经组织就比其他区域的神经组织先受到损伤。因而,海马区的神经组织常被当作研究脑缺血的主要模型[2]。

NPY在海马分布高度集中,许多研究证明它与学习、记忆功能密切相关[3],且NPY对脑血管的作用已有很多报道,在脑血液循环中,NPY能诱发较强的血管收缩,并使脑血液流速减慢。

CGRP(降钙素基因相关肽)含37个氨基酸,具有很强的舒张和促进血管生长,胚胎发育,刺激细胞生长,可能具有对MCI损伤神经元的修复有作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 雄性Wistar大鼠 中国医科大学动物室提供,CGRP、DAB、ABC试剂盒、兔抗NPY、羊抗兔血清(均购于Sigma公司),LUZEX-F显微图像分析仪(日本,松下公司)日立H-600透射电镜。

1.2 实验动物分组 本实验选用雄性Wistar大鼠40只,体重260~300 g,随机分成三组正常Wistar大鼠10只,分为正常。正常对照组:10只。手术组(治疗组):20只,手术组(模型组):10只;手术组(缺血对照组):10只。

1.3 实验方法

1.3.1 MCI模型制备 用1%戊巴比妥钠(40 ml/kg)腹腔注射麻醉后,作颈部正中切口,暴露左侧的颈总动脉,分别先后寻找颈内动脉与颈外动脉分叉处,做翼腭动脉结扎,并对颈外动脉充分剥离。在颈总动脉及颈内动脉远心端,分别用无损伤的显微外科血管动脉夹做可逆性夹闭。同时剪开颈外动脉,插入套管针,拔出针蕊,将其尖端插到距颈总动脉分叉约2 mm处,放开颈内动脉的血管夹,注入肝素盐水0.2 ml(含肝素10 IU),2.5%同种属大鼠全血悬浊液(将同种异体大鼠全血凉干研磨成细粉200 μm筛孔过筛备用.应用时用0.9%氯化钠注射液配置)0.5 ml。注射完毕,立即将颈外动脉结扎,于此同时,放开颈总动脉的血管夹,观察、逐层缝合。

1.3.2 缺血对照组动物模型制备 用1%戊巴比妥钠(40 ml/kg)腹腔注射麻醉后,作颈部正中切口,暴露左侧的颈总动脉,分别先后寻找颈内动脉与颈外动脉分叉处,做翼腭动脉结扎,并对颈外动脉充分剥离。在颈总动脉及颈内动脉远心端,分别用无损伤的显微外科血管动脉夹做可逆性夹闭。同时剪开颈外动脉,插入套管针,拔出针蕊,将其尖端插到距颈总动脉分叉约2 mm处,放开颈内动脉的血管夹,注入0.7 ml生理盐水。注射完毕,立即将颈外动脉结扎,于此同时,放开颈总动脉的血管夹,观察、逐层缝合。于手术后4 h处死、取脑。

1.3.3 组化标本制备 对实验动物用1%戊巴比妥钠(40 ml/kg)腹腔麻醉后开胸,经左心室70滴/min滴入1%肝素钠的生理盐水500 ml,同时剪开右心耳。继用0.1M磷酸盐缓冲液(PBS,PH=7.4)配制的固定液(含4%多聚甲醛)灌流固定。取出实验动物的大脑组织,放入含4%多聚甲醛PBS的固定液中进行后固定大约2 h,之后将实验动物的大脑组织切成薄片移入含20%蔗糖的PBS中。在4℃冰箱中存放,至组织薄片沉底,经水包埋,恒冷箱连续横切片,片厚20μm。经OCT包埋,恒冷箱连续切片,片厚16 m,-70℃保存备用。

1.3.4 尼氏染色

冰冻切片吹干,经PBS漂洗5 min×3次,将切片置入1%甲苯胺蓝溶液中37℃孵育90 min,取出后用蒸馏水冲洗,PBS漂洗5 min×3次,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,光镜下观察。

1.3.5 透射电镜技术 各组动物在1%戊巴比妥钠(40 mg/kg体重)腹腔麻醉下,用含1%肝素钠生理盐水200 ml快速冲洗后,用2%多聚甲醛及2.5%戊二醛的0.1M磷酸缓冲液250 ml灌流固定,灌流后立即取脑,参照包新民大鼠脑图谱切取海马组织块置于4℃,2.5%戊二醛中固定24 h,经1%锇酸固定1 h后,常规脱水,Epon812包埋,L.K.B超薄切片,醋酸铀、柠檬酸铅双重染色,日立H-600透射电镜观察并拍片。

1.3.6 ABC免疫组织化学染色 ①冰冻切片吹干,PBS冲洗5 min×3次;②1:50正常羊血清中孵育30 min;③倾去血清,加入兔抗NPY抗体(1:8000),4℃过夜;④PBS冲洗5 min×3次;⑤滴加生物素化抗兔抗体(二抗)1:40稀释,室温孵育60 min;⑥PBS冲洗5 min×3次;⑦滴加HRP标记的卵白素1:40稀释,室温孵育60 min;

⑧PBS冲洗5 min×3次;⑨DAB成色5 min;⑩PBS冲洗5 min×3次;B11梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,光镜下观察;B12对照实验在邻近切片上进行,用抗原吸收后的一抗代替一抗,结果为阴性。

1.4 显微图像定量分析 用Luzex-F显微图像分析仪测定海马CA4区单位面积NPY阳性细胞数量并计算出阳性细胞百分率,用(x±s)和%表示;测定海马CA4区单位面积NPY阳性细胞及纤维的平均灰度值,用(x±s)表示。结果进行统计学处理。

2 结果

2.1 尼氏染色和透射电镜结果 正常对照组和缺血对照组大鼠海马的尼氏染色切片上,神经元数量较多,排列紧密,形态完整,泡浆内尼氏体丰富。MCI组大鼠海马神经元出现明显的改变:核皱缩、核膜部分溶解、消失;线粒体肿胀、嵴紊乱甚至缺失;内质网扩张、脱颗粒;高尔基体扁平囊腔扩张;突触数量减少、前后膜融合、突触小泡不清或出现聚集。根据尼氏染色和透射电镜结果证明MCI动物模型制备成功。

2.2 ABC免疫组化结果 正常对照组和缺血对照组NPY阳性反应物分布于海马各区,阳性反应物呈棕褐色,细胞形态完整,纤维丰富。治疗组取材,阳性细胞及纤维数比正常对照组和缺血对照组NPY阳性反应物减少但比MCI模型组NPY阳性反应物增多。MCI模型组,阳性细胞及纤维数较正常对照组和缺血对照组NPY阳性反应物明显减少,且细胞形态不完整。

表1

MCI大鼠海马CA4区单位面积NPY阳性细胞百分率(x±s,%)

组别正常对照组缺血对照组实验组

治疗组MCI组

阳性细胞百分率33.5±1.2%33.0±2.3%22.3±3.6%**14.0±2.5%*

注:*与正常组比较P

表2

MCI大鼠海马CA4区单位面积NPY免疫反应平均灰度值(x±s,%)

组别正常对照组缺血对照组实验组

治疗组MCI组

阳性反应平均灰度值179.5±6.14186.2±6.75208.4±5.25**256.4±8.35*

注:*与正常组比较P

图1MCI大鼠海马CA4区单位面积NPY阳性细胞百分率

图2 MCI大鼠海马CA4区单位面积NPY免疫反应平均灰度值

3 讨论

本实验结果中,MCI时,海马NPY阳性细胞及纤维数量大大低于正常对照组及缺血对照组,这一实验结果尚未见文献报道。NPY参与血压、进食、记忆、神经内分泌以及下丘脑-垂体-肾上腺轴等许多功能的调节。并参与头痛、癫痫、抑郁等[4]广泛的病理生理过程。NPY在脑血管神经丛中含量最为丰富,在活体内及体外实验中具有强烈的血管收缩作用[5]。含有NPY的神经纤维与肾上腺素能神经的分布一致。现已证明脑血管周围的交感神经中NPY和肾上腺素共存,有学者推测脑血管NPY与肾上腺素一起在某些情况下,使脑血管持续收缩,从而维持脑血流。NPY在海马的分布高度集中,表明NPY在海马蕴藏着重要的生理功能。已往的研究证明NPY与学习、记忆功能密切相关,训练后的小鼠脑到内注射NPY,七天后重新测验,发现NPY可增进记忆的保持。有实验证明实,NPY对体外海马神经元有直接的兴奋性作用[6]。NPY可引起脑血流减少,而这种减少作用在海马特别明显[7]。NPY能抑制多种神经元释放递质,包括抑制海马内神经元释放谷氨酸,这提示NPY在脑损伤过程中很可能以一种保护性神经递质的身份出现。本实验运用免疫组织化学方法证明了MCI时,大鼠海马NPY免疫反应阳性细胞及纤维数量显著减少,结果提示NPY可能参与MCI的病理生理过程,可作为神经元受损的标示物。CGRP为含37个氨基酸,具有很强的舒张和促进血管生长,胚胎发育,刺激细胞生长。本实验中MCI受损伤的神经元在CGRP修复有作用下使NPY的含量增加,这样CGRP可为临床治疗MCI提供新途径。

参 考 文 献

[1] Stepien LS, Cordean JP, Rasmussen T. The effect of temporal lobe and hippocampal lesions of auditory and visual recent memory in monkey. Brain, 1960,83:470.

[2] Deshpande JK, Siesjo BK, Widoch T. Calcium accumulation and neuronal damage in the rat hippocampus following cerebral ischemia. J Vereb Blood Flow Metab,1987,7(1):89.

[3] Morley JF, Flood JK. Neuropeptide Y and memory paocessing. Ann N. Y. Acad Sci,1990,611:226-231.

[4] Hashimoto H, Onishi H, Koide S,et al. Plasma neuropeptide Y in patients with major depressive disorder. Neurosci Lett, 1996,216(1):57-60.

[5] Edvinsson L. Characteriztion of the contractile effect of neuropeptide Y in feline cereberal arteries. Acta physiol Scand, 1985,125:33.

[6] Brooks PA, Kelly JS, Allen JM, et al. Direct excitatiory effects of neuropeptide Y (NPY) on rat hippocampal neurons in vitro. Briam Res, 1987,408:295-298.

[7] Odazaki S, Sakok, Ylnemasur. Effects of intracarotid infusion of neuropeptide Y on cerebral blood flow in rat.Brain res, 1992;575(2):347-350.