治疗老年痴呆主要药效评价指标及其方法的研究进展

【摘要】目的 对治疗老年痴呆药物的药效指标与方法进行综述与评价。方法 从行为学指标、脑内有关物质含量检测指标、脑组织形态学观察指标、血液检测指标四个方面对以往的指标进行概述并对其他相关指标进行展望。结果 通过对药效指标和方法的探讨，为老年痴呆机理和治疗的研究提供新的、重要的数据源。结论 对老年痴呆主要药效评价指标和方法的深入研究对于找到有效预防和治疗老年痴呆的方法具有十分重要的意义。

【关键词】老年痴呆 行为学指标 脑内有关物质含量检测指标 脑组织形态学观察指标 血液检测指标

中图分类号：R592文献标识码：A文章编号：1005-0515（2010）12-030-03

【ABSTRACT】Objective To sum up and appraisal the evaluating indicators and methods of treating senile dementia. Methods Former indicators were summarized from four aspects of the behavior indicator, the examination indicator of related material content in brain, the brain tectology observation indicator and the blood examination indicator and other indicators were carried on the forecast. Results Through the discussion of drug efficacy targets and the methods,it provides newly and important data for the senile dementia mechanism and the treatment research. Conclusion There is a very important significance to find the effective mathods to prevent and treat the senile dementia by intensively studing main evaluating indicators and methods of treating senile dementia .

【KEY WORDS】Senile dementia; Behavior indicator; Examination indicator of related material content in brain; Brain tectology observation indicator ; Blood examination indicator

众所周知，人类社会己经逐渐进入老龄化社会，老年痴呆已成为威胁人类晚年身心健康的主要疾病之一，患病率呈逐年上升趋势。资料显示，研究者已针对脑的结构、功能和信息传递的新认知开发出了许许多多的治疗药物，且防治效果显著，但相关药效评价指标多散在于浩如烟海的文献中，为此本文总结相关文献，从行为学指标、脑内有关物质含量检测指标、脑组织形态学观察指标、血液检测指标四个方面对药物治疗老年痴呆进行药效评价，为老年痴呆机理和治疗的研究提供新的、重要的数据源。

1 行为学指标

1.1 水迷宫指标

20世纪80年代初，Morris发明了水迷宫，它是一种测量空间学习和记忆能力的实验方法，可用来评估啮齿动物由于老年痴呆等因素所造成的学习记忆的影响，目前已被认为是此类研究的经典。

Morris水迷宫实验由两个主要的实验组成，分别是定向航行实验和空间探索实验。

定向航行实验时，将动物从之前划分好的四个象限中随机放入，在最大游泳时间内，可以记录并作为评价指标的主要是逃避潜伏期（指大鼠自进入迷宫开始至找到平台所需的时间，经典的水迷宫实验以此作为主要指标进行统计分析），除此之外还有游泳路程长度（指大鼠自进入迷宫开始至找到平台游过的总距离。它是逃避潜伏期和平均游泳速度的乘积，是一个综合指标，受两者共同的影响，既可以反映大鼠对平台位置的学习记忆能力，又反映了大鼠的运动能力）、游泳速度（指大鼠进入水迷宫运动的快慢，速度的快慢，一般并不反映大鼠的学习记忆能力，仅反映大鼠的游泳能力。但在某种程度上，大鼠的逃避潜伏期短，那么相对消耗的体力也会少，速度也可能会较快。速度较快，那么，行程也可能会较长）、入水角度（指大鼠进入水迷宫后开始运动的方向与入水点和平台连线的夹角。如果与逃避潜伏期结合分析，在某种程度上可以弥补单纯考虑时间的不足）、搜索策略等可作为评价指标的补充，在分析过程中起参考作用，这个实验主要用于评价动物的空间学习能力。对于最大游泳时间，各实验人员有不同看法，通常选择 120s，90s或60s。最大游泳时间会在统计中由于个别动物而影响整组数据，特别是选择较大的游泳时间时，因此，应该在实验前做好动物的筛选工作，并在统计数据时去掉异常值。

定向航行实验进行几天后（按动物学习情况定），开始空间探索实验，将平台撤去，一般探索时间在90s或60s内[2]，可以记录并作为评价指标的主要有寻求原平台的次数（也就是跨平台次数：是在撤去平台后，动物穿越原平台所在位置的次数，反应动物寻找平台的能力，与原平台象限停留时间结合起来考虑更能反应大鼠的学习记忆能力的变化）、原平台象限的游泳时间，原平台象限游泳时间占总时间百分比，这个实验主要用于评价动物的空间记忆能力。

水迷宫实验作为老年痴呆动物的评价指标来说充分而又准确的，是最常用的评价治疗老年痴呆药效的指标，但是它也有不足之处，Graziano [3]认为简单地使用目前常用的观测指标不能准确的反映真实的搜索策略，于是选择了一些自定义的行为种类、大量的数值变量和重要区域，使用判别式分析的方法来获得较高的准确率。Graziano的这种方法虽然准确但是种类繁多比较复杂，所以我们进行日常实验时，只要选择主要的评价指标补充几个次要指标就可以清楚地反映实验的结果了。

1.2 跳台实验指标

跳台实验是药理学常用的评价动物对药物及其他给予的干预后的神经行为学中一个测试现象较为明显的实验，也就是测量大小鼠记忆能力的变化的实验。跳台实验指标是评价药效常用的指标之一，从文献的记录中看实属完善成熟。

检测方法：将大鼠或小鼠放入跳台仪内适应环境,然后通电,大多数跳上跳台逃避电击。从通电到完全稳定上台所用的时间为潜伏期,跳下时大鼠双足同时接触铜栅视为错误反应,训练并记录训练时间内的潜伏期和错误次数作为学习指标。24h后重测,先将大鼠或小鼠放在跳台上,记录第1次跳下跳台时间为潜伏期,并记录错误次数作为记忆能力指标。

2脑内有关物质含量检测指标

老年痴呆发病机制复杂，多种信号通路参与此过程，许多信号分子在其中发挥重要作用[4]。目前已公认，学习记忆与中枢胆碱神经系统关系极为密切。研究还表明，患者的痴呆程度与皮质和海马中信号分子的缺失程度密切相关，在患者脑中，基底前脑的胆碱能神经细胞明显丢失，胆碱能神经纤维发生退变，AchE、谷氨酸、p-KER2等在脑内的表达出现异常，尤以皮质和海马显著。

2.1 胆碱酯酶（AchE）活性的检测

胆碱酯酶是胆碱能神经递质乙酰胆碱的水解酶直接参与自主神经功能调节、肌肉运动、大脑思维记忆等重要功能。研究证实老年痴呆患者中枢胆碱能系统损伤，AchE活性和突触前胆碱能标志在多处脑区均显著降低或缺失患者基底前脑区胆碱能神经元丢失，从基底节到皮质，胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性降低和乙酰胆碱酯酶(AChE)活性明显升高，造成乙酰胆碱 (ACh)的合成、储存和释放减少，皮质 ACh受体数目减少，产生痴呆症状 [5]。总的来说，老年痴呆患者脑组织中胆碱乙酰化酶活性明显降低，胆碱酯酶活性显著升高，造成 ACh含量不足，导致中枢神经系统功能障碍，出现学习记忆及认知功能下降，甚至智力丧失[6]。因此AchE活性的检测作为评价老年痴呆药效的主要指标，且在药效评价中的使用甚为频繁。

检测方法：断头法处死实验动物后，迅速取脑，用预冷的生理盐水冲净表面血液，用滤纸吸干，去除软脑膜血管。取右脑称重，置微型匀浆器中，加无水乙醇研磨，再加生理盐水充分研磨制成匀浆。冷冻离心机离心，取上清液。用羟胺比色法测定AChE活性(可按照试剂盒说明书进行操作)。

2.2 谷氨酸含量的测定

谷氨酸是脑内主要的兴奋性神经递质，介导兴奋性突触传递，并与长时程增强（long term potentiation LTP）的形成密切相关 [7]，也作为老年痴呆药效的相关评价之一。

检测方法：在海马组织中加入HCL溶液，冰浴下超声匀浆，低温离心，取上清液加入正亮氨酸为内标物，利用异硫氰酸苯酯衍生，用内标法测定谷氨酸含量[8]。

2.3 p-KER2含量的测定

p-KER2含量测定：将海马组织放到预冷的裂解液中。低温超声粉碎后，离心，取上清液分装。用Braford法测定蛋白质含量，以牛血清白蛋白为标准品。用磷酸化抗体，常规Western蛋白印迹法测定p-KER2含量[9]。扫描蛋白条带，进行吸光度分析，吸光度值代表p-KER2含量。

2.4 Aβ和S.P含量的测定

Aβ由分泌酶水解β淀粉样前体蛋白产生，称为β-淀粉样肽，Aβ生成的增多对神经元有毒性作用[10]，大脑海马组织形态也发生明显的变化。而Aβ被认为是导致神经元损伤及认知功能衰退的主要致病物质[11]。

S.P是世界上发现最早的神经肽，研究表明，S.P与学习记忆功能有关，且对中枢神经系统具有保护作用，向人们提示了其对老年性痴呆等神经系统疾病具有潜在的防治价值[12]。

因此Aβ和S.P含量的测定对药效的评价有着重要的作用。

2.5 皮质的蛋白含量的测定

检测方法：分离脑皮质，称重，组织加入磷酸盐缓冲液（PBS）液，在组织匀浆器中充分研磨后，离心，吸取上清液，用PBS按1:4的比例配成组织匀浆液。最后用酶标仪微量比色法测定皮质匀浆液的蛋白含量。

3 脑组织形态学观察指标

3.1 海马病理形态观察

海马组织主要负责存储信息,是人学习和记忆的关键部位。海马结构的整合是空间学习的基础，海马区的受损影响大鼠学习行为的实验结果，和临床患者健忘、痴呆等表现是一致的[13] 。海马萎缩被看成是与记忆损伤相关的重要指标，也是评价药效的主要指标之一。

检测方法：断头处死，开颅取出完整的脑组织，用10%的福尔马林固定，切取脑组织，石蜡包埋，连续切片，行HE常规染色，进行细胞形态学观察。

3.2 检测海马及边缘系统的胆碱能神经元丢失状况

老年痴呆患者的病理学特征是大量神经细胞内神经纤维缠结、细胞外老年斑和弥漫性脑萎缩[14]。计算神经元数目检测海马及边缘系统的胆碱能神经元丢失状况可以直观简单地推测出患者的生理状态，是评价药效的重要指标。

3.3 病理组织切片及免疫组织化学染色

病理组织切片及免疫组织化学染色只要在光学显微镜下，老年痴呆动物模型内部结构的病理变化就一目了然，从而透彻地解析老年痴呆的病因和发病机制。

检测方法：开颅取脑后固定、脱水等过程后，进行冠状冷冻切片。切片PBS冲洗，经过溶于 PBST进行过氧化反应，封闭处理后，加入鼠抗摇匀、孵育过夜。然后，在室温下加入生物素化羊抗鼠IgG摇匀、孵育，室温摇匀、孵育，显色。最后，经过常规粘片、干燥、脱水、透明、封片，光学显微镜下观察并拍摄。

4 血液检测指标

近年来的研究表明，血液指标的检测不仅可预测患上老年痴呆的风险，其准确率高达90%，还可以作为不可或缺的药效评价指标，专家认为，血液检测有望为人类防治老年痴呆症带来革命性变化。

4.1 血清β淀粉样蛋白、转化生长因子及类胰岛素样生长因子Ⅱ水平检测

分泌酶水解β淀粉样前体蛋白产生Aβ,而Aβ又是导致认知功能衰退的主要致病物质，所以老年痴呆伴有β-淀粉样蛋白沉积，可通过检测血清β淀粉样蛋白的水平来估计Aβ的含量。

检测方法：取血分离血清,血清β淀粉样蛋白、转化生长因子及类胰岛素样生长因子Ⅱ检测采用放免法。

4.2 超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)羟自由基的含量检测

检测方法：快速开胸，心脏取血，离心取血清，置于低温保存，按试剂盒说明书，紫外分光光度法检测超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)羟自由基的含量观察动物脑组织形态学的病理变化。

4.3 血液流变学检测

研究表明，血液流变学异常是导致血液成分改变的主要因素之一。有研究认为，高黏血症是痴呆的危险因素之一。其机制可能与血液黏滞度异常则血流变慢，血液黏稠度增加而致脑血流量下降，脑部缺血缺氧，损害大脑的学习记忆功能有关[15]。血液流变学检测也可以评价药物疗效的好坏。

5 小结

到目前为止，各种药效评价指标层出不穷，除了上述常用的指标外，按照每种治疗方法或者药物对此疾病改善的不同，检测的指标也会有所不同，如晚期老年痴呆存在严重氨基酸代谢障碍，脑脊液，血浆中兴奋性氨基酸谷氨酸、天门冬氨酸含量的测定具有重要价值；老年痴呆能引起nNOS和NO表达增加，而MTPG(代谢型谷氨酸受体阻断剂α-甲基-（4-四唑基-苯）甘氨酸能阻断老年痴呆诱导的nNOS表达增加[16]，因此nNOS含量的检测在MTPG这种受体阻断剂的影响下有相对重要的意义等。还有血糖指标，海马颞叶中D2受体变化、载脂蛋白E的含量等等都与老年痴呆的机理息息相关，由于这些指标多而杂是近几年的研究发现，还未得到广泛的应用及证实，还未成熟，故本文只选取了一些成熟、常用、重要且有效的指标及其检测方法进行整理归类，为以后的研究提供更方便的查找途径，但是归类的指标中也还很多细节到现在为止还没有透彻，值得进一步研究、完善，使其更加适用于老年痴呆的机制探讨和药理研究。

这些评价指标的整理与总结以老年痴呆药理学的研究为基础，以评价药效为目的，从而为多层次、多角度深入研究老年痴呆的发病机理奠定了基础，为药物治疗老年痴呆提供更多的途径，有利于进一步提高药物治疗老年痴呆的疗效以及临床价值，并为研究开发疗效更高、毒性更小的治疗老年痴呆的药物提供更多思路。

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