大豆根部菌落构成研究

东北黑土区是我国重要的商品粮基地, 也是大豆主产区。作物产量与品质不仅受基因型的控制,而且受环境因素的影响, 尤其是植物有益根际细菌(plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)[1], 因其能促进植物生长、增加作物产量而开始受到人们的关注, 其作用是帮助作物吸收营养物质或者合成某种化合物(如生长激素)供植物利用[2]。

农业生产正面临着保障高产优质的同时还要实现环境友好的挑战[3], 因此, 以 PGPR 为核心的生物肥料研究与开发已经成为国内外研究的热点[4 6]。Kavino 等[4]研究结果表明, PGPR 能够促进作物生长、产量增加和生理代谢能力提升, 在作物生产的可持续性和环境友好产品的生产方面具有较大的潜力。Joe 等[7]研究结果表明, PGPR 能够提升作物对逆境的耐受能力。因此, 筛选特定作物的 PGPR 菌株,从而为生产生物肥料提供有效生物源, 已经受到国内外学者的广泛重视[8]。国内专家学者近年来分别对玉米[9 10]、小麦[11]、水稻[12]、油菜[13]、棉花[14]等作物 PGPR 的筛选和应用进行了大量研究, 研究结果证明 PGPR 菌种资源丰富, 对作物的健康和产量形成有较大促进作用。但有关我国东北黑土区大豆根际 PGPR 分布规律的系统研究还鲜有报道。本研究于 2010 年春季对东北黑土区大豆根际土壤中PGPR 菌资源进行了全面调查、研究和分析, 旨在了解大豆 PGPR 在东北地区大豆根际的生态分布规律,并收集 PGPR 菌资源, 为进一步研制适合东北黑土区大豆促生菌肥料建立菌种资源平台。

1材料与方法

1.1采样地点与采样方法

2010 年 5 月 25 日—6 月 5 日分别在内蒙古自治区鄂温克族自治旗(NE)、黑龙江省海伦市(HH)、黑龙江省克山县(HK)和黑龙江省农垦红兴隆农场(HX)采样, 采样区位于我国东北主要黑土区, 大豆品种为“东农 45 号”, 采样点具体信息见表 1。大豆所处生长阶段为花芽分化期, 取样样方面积约 1 000 m2, 通过“S”形多点混合法采集各样点大豆根际土壤样品, 作物根际土样采集采用“抖根法”[15], 取样后放在无菌自封袋中, 然后置于放有冰块的保温箱内, 迅速运回实验室, 在 24 h 内完成菌株的分离工作。

1.2培养基及磷细菌的分离、计数与鉴定

固氮菌分离采用 Ashby 无氮培养基; 解磷菌分离采用有机磷培养基, 卵磷脂用卵黄代替; 溶磷菌分离采用无机磷培养基; 硅酸盐细菌分离采用亚历山大罗夫培养基[16]。称取混合好的 1 g 新鲜土样, 放在 99 mL 装有150 个玻璃珠的无菌水中, 震动 30 min 制成悬液后进行 10 倍系列稀释, 将样品涂布于有机磷培养基、无机磷培养基、无氮培养基和亚历山大罗夫培养基平板上, 根据生长菌落在平板上形成透明圈情况,统计细菌、解磷菌和溶磷菌数量。根据菌株革兰氏染色、芽孢染色、运动性、葡萄糖氧化、接触酶、吲哚、甲基红、V-P 测定、淀粉水解、需氧性、氧化酶等形态及生理生化特征, 参照文献[17]初步鉴定菌属, 并对优势菌群初步鉴定结果根据 16S rDNA序列分析进行修正。

1.3统计分析方法

大豆根际 PGPR 菌多样性指数(H′)根据 Shan-non-Weiner 指数公式计算:式中, k 为某作物根际 PGPR 菌属总数, Pi为 i 菌属细菌菌株数占全部 PGPR 菌株数的百分比。采用 DPSv 7.05 版软件进行分析并作图。

2结果与分析

2.1东北黑土区大豆根际促生菌种群组成

2.1.1自生固氮菌

在中国东北典型黑土地区大豆根际自生固氮菌数量较为丰富(表 2), 数量为(7.63±0.98)×104~(19.17±3.41)×104cfu•g 1, 其中以内蒙古鄂温克族自治旗样品中最多, 黑龙江省海伦市样品最少, 但自生固氮菌总数均处于同一数量级上。对分离的自生固氮菌株进行鉴定发现(表 2), 菌种分别属于固氮菌属和芽孢杆菌属 2 个属, 有褐色球形自生固氮菌、敏捷固氮菌、多粘芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和印度拜耶林克氏菌 4 个种, 内蒙古鄂温克族自治旗和黑龙江省海伦市的样品中含有所有的已鉴定属种, 黑龙江省克山县的样品中含有 2 个属 3 个种, 黑龙江红兴隆农场的样品中含有 2 个属 4 个种, 其中固氮菌属褐色球形自生固氮菌、固氮菌属敏捷固氮菌和芽孢杆菌属胶冻样芽孢杆菌为 4 个地区的共有菌。

2.1.2溶磷菌

溶磷菌能够把土壤中的固定化无机磷元素转化为植物可利用的有效态磷, 在土壤的磷素转化中起着重要的作用, 尤其是在碱性和中性土壤中[18]。比较 4 个取样点的溶磷菌总数(表 2), 黑龙江省克山县和黑龙江省红兴隆农场两个取样点的数量较多, 总量达 20×105cfu•g 1以上, 内蒙古鄂温克族自治旗和黑龙江省海伦市 2 个取样点的数量相对较少, 总量在 10×105cfu•g 1以上。在 4 个取样点大豆根际中分离到具有溶磷能力的细菌共计 6 个属(表 2), 分别为芽孢杆菌属、固氮菌属、节杆菌属、产碱菌属、微球菌属和假单胞菌属, 内蒙古鄂温克族自治旗的样品中含有 5 个属, 黑龙江省海伦市的样品中含有 3个属, 黑龙江省克山县的样品中含有 4 个属, 黑龙江省红兴隆农场的样品中含有 5 个属, 其中固氮菌属和节杆菌属为 4 个地区共有菌属。

2.1.3解磷菌

4 个取样点中内蒙古鄂温克族自治旗的解磷菌总数最多, 为(7.33±2.24)×105cfu•g 1, 黑龙江省克山县的解磷菌总数最少, 为(2.02±1.01)×105cfu•g 1。总体上东北黑土区大豆根际解磷菌数量较为丰富。对分离的解磷菌菌株进行鉴定结果表明, 解磷菌共来源于细菌的 7 个属, 分别为假单胞菌属、微球菌属、欧文氏菌属、埃希氏菌属、棒杆菌属、产碱菌属和固氮菌属, 内蒙古鄂温克族自治旗的样品中含有 5个属, 黑龙江省海伦市的样品中含有 6 个属, 黑龙江省克山县的样品中含有 6 个属, 黑龙江省红兴隆农场的样品中含有 5 个属, 其中微球菌属、欧文氏菌属和固氮菌属在东北黑土区有广泛分布(表 2)。

2.1.4硅酸盐细菌

东北黑土区大豆根际硅酸盐细菌相对于其他类促生菌数量较少(表 2), 低约 1~2 个数量级, 总数在(0.37±0.61)×103~(1.72±0.47)×103cfu•g 1之间, 这可能与黑土中钾素含量较为丰富有关[19]。4 个取样点的大豆根际硅酸盐细菌属于拜叶林克氏菌属、德莱氏菌属、金氏菌属和芽孢杆菌属。内蒙古鄂温克族自治旗的样品中有 2 个属, 黑龙江省海伦市的样品中有 2 个属, 黑龙江省克山县的样品中有 4 个属, 黑龙江省红兴隆农场的样品中含有 3 个属, 其中芽孢杆菌属的硅酸盐细菌在 4 个取样点均有分布。

2.2东北黑土区大豆根际促生菌多样性分析

Shannon-Weiner 指数是用来描述种的个体出现的紊乱和不确定性, 不确定性越高, 多样性也就越高, 包含丰富度和均匀性两个因素[20]。由表 3 可知,取样点大豆根际自生固氮菌多样性指数在 0.94~1.60之间, 溶磷菌多样性指数在 0.83~1.52 之间, 解磷菌的多样性指数在 1.07~1.67 之间, 硅酸盐细菌多样性指数较低, 在 0.52~0.96 之间。4 个取样点大豆根际促生菌的多样性指数均大于 2, 说明东北典型黑土区大豆根际促生菌整体丰富度较高, 均匀性较好。

2.3东北典型黑土区与大豆根际促生菌的对应性分析

对应分析又称 R-Q 分析, 它是在 R 型和 Q 型因子分析基础上发展起来的一种多元统计分析方法[21],本试验设定取样点为 Q 因子, 菌种为 R 因子, 分析菌种与地域之间的对应关系。图 1 中的“”代表取样点, 并用取样点的简称进行标示, “”代表菌种,用菌种编号进行标示。对应分析结果表明, AXIS1 和AXIS2 可以代表群体特征的 78.3%(图 1), 4 个取样点分别处于二维图谱的 4 个象限, 说明 4 个典型黑土区域大豆根际促生菌种群结构具有明显的差异, 内蒙古鄂温克族自治旗的特征种为自生固氮菌 LLN8(A. beijerinckia indica), 黑龙江省海伦市的特征种为溶磷菌 DHS13 (Micrococcus), 黑龙江省克山县的特征种为溶磷菌 DHS19 (Pseudomonas), 黑龙江省红兴隆农场的特征种为自生固氮菌 LLN1 (A. chrooco-ccum)和溶磷菌 DHS5 (Azotobacter)。

自生固氮菌 LLN2 (A. azomonas)和 LLN6 (B3 讨论与结论植物促生菌菌群在促进植株健康和逆境忍耐力方面起着重要作用[22], 本研究发现, 中国东北典型黑土区的大豆根际土壤中有大量促生菌, 自生固氮菌达 104cfu•g 1, 溶磷菌和解磷菌达 105cfu•g 1, 硅酸盐细菌达 103cfu•g 1。臧威等[5]研究结果表明, 东北地区 4 种作物根际磷细菌数量在 104cfu•g 1以上;于翠等[15]对甜樱桃(Cerasus sachalinensis)根际磷细菌分布的研究表明, 其解磷菌和溶磷菌数量均达105cfu•g 1以上。上述研究与本研究的结果接近。本研究从大豆根际土样中分离得到具有自生固氮能力的菌株 5 株, 溶磷菌 6 株, 解磷菌 7 株, 硅酸盐细菌4 株, 获得了大量的大豆根际促生菌种质资源。东北 4 个典型黑土区大豆根际促生菌具有较高的多样性指数, 自生固氮菌、解磷菌、溶磷菌和硅酸盐细菌的多样性指数均在 1 左右, 与臧威等[5]在东北地区 4 种作物的促生菌多样性指数结果类似。促生菌整体多样性指数4个地区均大于2, 说明大豆根际促生菌群落结构较为复杂, 丰富度较高, 均匀性较好。

对应分析能够很好地反映研究对象与变量之间的关系[21], 利用对应分析对东北 4 个典型黑土区大豆根际促生菌种群结构进行解析, 发现 12 株菌受地域影响不明显, 与菌株数量相结合可以确定 LLN2(A. azomonas) 、 LLN6 (B. mucilaginosus) 、 DHS9(Arthrobacter) 、 DHSO2 (Pseudomonas) 、 DHSO14(Erwinia) 、 DHSO17 (Corynebacterium) 和 LSJ21(Bacillus)在东北黑土区大豆根际分布较为广泛, 可用于研发东北黑土区大豆专用型复合生物肥料。

总之, 在东北黑土大豆根际蕴藏着丰富的促生菌菌种资源, 促生菌的群落结构复杂多样。本研究了解了大豆根际促生菌的生态分布规律, 获得了大量的促生菌种质资源, 通过对应性分析确定了中国东北黑土区优势大豆根际促生菌, 为进一步研制适合东北黑土区高效复合生物肥料奠定了基础。