超高压结合热处理对肌球蛋白凝胶特性及蛋白二级结构的影响

摘 要：肌球蛋白溶液先经100～600MPa压力预处理10min，处理温度20℃，后加热制备凝胶，以未超高压处理组为对照组，测定凝胶质构和保水性，采用傅里叶红外光谱法测定肌球蛋白二级结构变化，然后通过相关系数矩阵法研究肌球蛋白7种质构特性、保水性与各二级结构含量的关系。结果表明：不同超高压处理对肌球蛋白凝胶硬度的影响不显著，对凝胶保水性影响显著，随着压力升高，凝胶保水性逐渐下降。与对照组相比，100、200MPa处理的凝胶保水性无显著差异；与对照组相比，300MPa以上处理的凝胶保水性显著减少。超高压致使肌球蛋白分子结构展开，使蛋白质β-折叠等有序结构减少而β-转角等无序结构增加。从相关性分析结果得出，凝胶的黏附性、弹性、保水性与各二级结构之间存在显著的相关性。

关键词：超高压；肌球蛋白；凝胶；傅里叶红外光谱；蛋白质结构

Combined Effect of Ultra High Pressure and Heating on Gel Properties and Secondary Structure of Myosin

CAO Ying-ying1，2，ZHANG Liang2，WANG Peng1，ZHOU Guang-hong1，XU Xing-lian1，*

（1. Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control， Ministry of Education， National Center of Meat Quality and Safety Control， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China； 2. Huangshan University， Huangshan 245041， China）

Abstract：For the preparation of heat-induced myosin gels， myosin solution was subjected to ultra high pressure （UHP） pretreatment at 100―600 MPa and 20 ℃ before heat treatment. Heat-induced myosin gels with and without UHP pretreatment were determined for texture properties and water-holding capacity. Fourier transform infrared spectroscopy was used to examine secondary structure changes of myosin. In addition， the relationships of secondary structure contents with 7 texture parameters and water-holding capacity was analyzed using a correlation coefficient matrix. The results obtained demonstrated that UHP pressure did not significantly influence the hardness of myosin gels but had a significant negative correlation with the water-holding capacity. UHP treatments at 100 MPa and 200 MPa did not cause significant differences in the water-holding capacity of myosin gels in comparison with control groups， although UHP treatments at a pressure level higher than 300 MPa resulted in a significant reduction in the water-holding capacity of myosin gels. The molecular structure of myosin was unfolded after UHP treatment， causing a decrease in the amount of ordered structures such as β-sheet and an increase in the amount of unordered structures such as β-turn. Heat-induced myosin gels showed a significant correlation of secondary structure contents with adhesiveness， springiness and water-holding capacity.

Key words：ultra-high pressure；myosin；gels；FT-IR spectroscopy；protein structure

中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）01-0001-07

超高压技术（ultra high pressure processing，UHPP），可简称高压技术（high pressure processing，HPP），静水压技术（high hydrostatic pressure，HHP）。食品超高压技术就是将食品原料包装后，密封于超高压容器中（常以水或其他流体介质作为传递压力的媒介物），利用100MPa以上的压力（常用的压力范围是100～1000MPa），在一定的温度下加工适当的时间，引起食品成分、非共价键（氢键、离子键和疏水键等）的破坏或形成，使食品中的酶、蛋白质、淀粉等生物高分子物质分别失活、变性和糊化，并杀死食品中的细菌等微生物，从而达到食品灭菌保藏和加工的目的。超高压处理对食品作用均一、迅速，不受体积和形状的限制，对食品的营养和风味破坏较小。

肌肉蛋白质占肉总质量的15%～22%，是肉中具有重要生物学功能特性的组成成分。肌球蛋白是肌肉中含量最高最重要的蛋白质，约占肌肉总蛋白质的1/3，它的功能特性决定肉制品的质构、感官品质、切片性、保水性、乳化稳定性和产品得率。在肌肉凝胶形成过程中，肌球蛋白发生复杂的功能特性及结构变化，这些变化受温度、压力、pH值、蛋白质浓度、离子强度、不同肌肉类型及添加物的影响。

蛋白质分子是由氨基酸残基首尾相连而成的共价多肽链组成，每一种天然蛋白质都具有自己特定的空间结构，这种空间结构通常称为蛋白质分子构象。氨基酸序列决定了蛋白质的基本特性，因此被称为一级结构。一般而言，蛋白质结构的变化引起其功能性质的变化，蛋白质的功能主要由其特有的三维空间结构所决定[1]。一般的加热或者超高压处理不能改变蛋白质的一级结构。蛋白质的三级和四级结构，通过侧链（伸出链）间的氢键、静电相互作用、疏水作用、范德华力和二硫键来维持的；而二级结构是通过蛋白质主链上C=O和N―H间的氢键作用来维持。

超高压处理改变蛋白质结构，100～150MPa改变蛋白质四级结构，大于200MPa改变蛋白质三级结构，改变蛋白质疏水性和巯基含量[2]；大于700MPa的压力诱导蛋白质二级结构发生不可恢复的变性[3]。蛋白质结构的改变对蛋白质的功能特性和食品品质有重要的影响[4]。

蛋白质二级结构的测定方法，主要有激光拉曼光谱法、圆二色谱法及傅里叶红外光谱法等。拉曼光谱信噪比低，酰胺Ⅰ带本身的信号强度低，受荧光背景干扰；圆二色谱法只能应用在很低浓度范围内的澄清溶液中。傅里叶红外光谱法可以测定任何气态、液态和固态样品。

红外在多个波段对蛋白质中与二级结构有关的C=O、N―H和C―N的不同振动方式有吸收，其中，酰胺Ⅰ带（1600～1700cm-1）和酰胺Ⅲ带（1220～1330cm-1）常被用来指认蛋白质的二级结构；酰胺Ⅲ带能排除水峰的影响，与已知的二级结构有很好的吻合，但其吸收是多种振动吸收的加和，无法用简明的理论来解释，因此，本研究用酰胺Ⅰ带（1600～1700cm-1）研究其二级结构的变化。对于酰胺Ⅰ带经过谱峰拟合后各子峰与二级结构的对应关系，目前研究的比较成熟[5]。

酰胺Ⅰ带（1600～1700cm-1）的红外吸收主要与C=O的伸缩振动有关。1600～1639cm-1被指认为β-折叠，1640～1650cm-1被指认为无规则卷曲（C=O与水形成氢键）；1651～1660cm-1被认为为α-螺旋结构；1661～1700cm-1被指认为β-转角结构[6]。

本研究采用傅里叶红外光谱法结合计算机软件技术，测定不同压力预处理结合加热形成凝胶中肌球蛋白二级结构的变化，同时测定凝胶的质构特性和保水性，对蛋白质结构与功能特性进行相关性分析，建立蛋白质结构与功能特性的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3月龄雄性新西兰白兔（2.0～2.5kg），购于江苏省农业科学院。

氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙二醇-双-（2-氨基乙醚）四乙酸（EGTA）、Triton X-100、Tris、二硫苏糖醇（DTT）、EDTANa2、氯化镁、ATPNa2、牛血清蛋白（BSA）、溴化钾均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

Waring Blender 8010ES高速度组织匀浆机 美国Waring公司；Beckman Avanti J-E高速离心机 美国 Beckman Coulter公司；Ultra Turrax T25 BASIS高速匀浆器 德国IKA公司；TA-XT plus质构仪 英国 Stable Micro Systems公司；HH-42 水浴锅 常州国华电器有限公司；UV-2450岛津紫外分光光度计 日本岛津公司；PH 211 HANNA 台式酸度计 葡萄牙Hanna公司；MUL-9000H20纯水机 昆山总馨机械有限公司；SIM-F124SANYO制冰机 日本三洋公司；NEXUS670型傅里叶红外光谱仪器 美国尼高力公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

健康的新西兰白兔，宰前充分休息过夜，以减少应激。机械击昏后切断颈部血管，充分放血，迅速剥皮，去头、内脏、爪，先后用自来水、蒸馏水冲洗以去除血迹。将腰大肌（pasoas major，PM）剥离后，0.5h内剔除可见脂肪和结缔组织，切碎后称质量。在0～4℃条件下提取肌球蛋白。提取方法根据参考文献[7]。

1.3.2 蛋白质浓度测定

采用双缩脲法测定蛋白质浓度，以牛血清蛋白（BSA）作为标准蛋白[8]。

1.3.3 超高压-加热凝胶制备

肌球蛋白溶液用磷酸盐缓冲液（0.6mol/L NaCl，pH6.5，20mmol/L NaCl）稀释到约20mg/mL。肌球蛋白溶液放在5mL冻存管中（勿留空隙和气泡），放在超高压腔体中，在压力100、200、300、400、500、600MPa条件下保压10min，超高压温度为室温20℃，对照组为传统加热凝胶即未高压处理凝胶，高压处理后的样品置于水浴锅中从20℃程序升温（1℃/min）到70℃，保温20min。凝胶在0～4℃条件下放置24h，进行下述指标测试。

1.3.4 凝胶质构测试

测试前，凝胶在室温中放置平衡2h，然后用质构仪进行测量，使用的参数为：Load cell：25kg；探头：P5，5mm cylinder Stainless；Test mode option：TPA；Pre-Test Speed：1.0mm/s；Test Speed：1mm/s；Post-Test Speed：2mm/s；Distance：15.0mm；Trigger Force：8g；Trigger Type：Auto；Data Acquisition Rate：200pps；测试完成后，用仪器自带软件Texture Expert Exceed 2.64a对测试结果进行处理。每个处理做4个重复。测定指标如下：硬度、弹性、回弹性、黏附性、黏聚性、胶黏性和胶黏性。

1.3.5 凝胶保水性测试

保水性（WHC）通过Kocher等[9]的离心法测量，肌原纤维蛋白凝胶在0～4℃条件下用10000×g离心10min，记录离心前后离心管的质量，离心出液体的质量，每个处理有4个重复。按下式计算WHC。

式中：mML为离心过程中水分损失质量/g，mCG为离心前凝胶的质量/g。

1.3.6 肌球蛋白二级结构测定?（傅里叶红外光谱法）

制备的凝胶在-80℃冷冻4h左右，再置于真空冷冻干燥机上进行冷冻干燥，直至凝胶完全干燥，用研钵将凝胶研成粉末，经80目过滤筛过滤后，装于10mL离心管中备用。

取出上述冷冻干燥处理后的凝胶与无水溴化钾（约150～200mg）充分混合，在约1333.2Pa/cm2的压力下加压15min形成溴化钾压片。用红外光谱仪对其进行测量和分析，分辨率为4cm-1，扫描累加32次，光谱观察范围为400～4000cm-1。主要测量1600～1700cm-1范围内酰胺Ⅰ谱带，用Origin 8.5软件分析位于1600～1700cm-1波段属于酰胺Ⅰ带特征峰的图谱。先经二阶导数求导，得到子峰数目在8～12之间，再校正基线，然后用 Gaussian曲线去卷积、进行多峰拟合[10-11]。进行多次拟合使残差最小。根据峰面积计算各二级结构的比率。各子峰与二级结构对应关系为：1600～1640cm-1为β-折叠；1640～1650cm-1为无规卷曲；1650～1658cm-1为α-螺旋；1660～1695cm-1为β-转角。

1.4 数据统计

用SPSS13.0进行单因素方差分析，如果方差分析效应显著，使用Duncan multiple range test进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 高压处理对肌球蛋白凝胶硬度的影响

由图1可见，未超高压组凝胶硬度为74.95g，与未超高压组相比，100～300MPa处理的凝胶硬度下降（P>0.05），原因是蛋白质分子被打开，水分子进入，使凝胶硬度下降。胡飞华等[12]用300MPa超高压处理鱼糜后，发现凝胶硬度仅为热处理的67%，在弹性、内聚性、咀嚼性、持水性和白度方面，超高压处理组均高于热处理组，其中弹性增加明显，为热处理的1.6倍。与未超高压组100、200、300MPa相比，400MPa处理的凝胶硬度达到最高值为75.19g（P>0.05），原因是蛋白质分子变性，分子聚集增加，硬度升高。Kajiyama等[13]发现，和传统的通过热处理加工获得的豆腐相比，超过300MPa压力形成的凝胶具有更大的硬度。说明一定的压力，可以提高凝胶类产品的硬度。与前4组凝胶相比，500、600MPa的硬度下降（P>0.05），但并不显著。王苑等[14]将鸡肉肌原纤维蛋白和大豆分离蛋白按体积比1：1混合的凝胶经100MPa超高压预处理后，经55℃加热20min可以形成较好的凝胶，硬度、弹性、保水性比未经超高压处理的分别提高了35.50%、27.71%、47.29%。张宏康等[15]用400MPa、45℃条件下获得最高的大豆蛋白凝胶强度，而在500MPa 压力，35℃和45℃条件下，凝胶强度下降。在实际生产中，控制小于400MPa的压力对凝胶质构有利。

图 1 不同高压处理对肌球蛋白凝胶硬度的影响

Fig.1 Effect of UHP treatment at different pressure levels on the hardness of myosin gels

2.2 高压处理对肌球蛋白凝胶保水性的影响

图 2 不同高压处理对肌球蛋白凝胶保水性的影响

Fig.2 Effect of UHP treatment at different pressure levels on the water-holding capacity of myosin gels

由图2可见，未超高压组凝胶保水性为61.15%，与未超高压组相比，100、200MPa处理的凝胶保水性下降（P>0.05），与未超高压组及100、200MPa高压处理相比，300MPa以上的压力，凝胶保水性显著下降（P0.05）。原因是，压力超过300MPa，蛋白质分子发生部分或者完全变性，导致蛋白质溶解度下降，再加热处理致使蛋白质分子失水，这一结果与文献[13-18]结果不同，可能是由于研究材料不同和测定保水性方法不同所致。压力处理降低肌球蛋白凝胶保水性的另一原因可能是，超高压处理使肌球蛋白分子的疏水性增加，分子之间结合更加紧密，分子空隙减少，保留水分的空间减少。

2.3 高压处理对肌球蛋白二级结构的影响

a～g. 分别为未超高压处理组及100、200、300、400、500、600MPa处理组。图4、5同。

图 3 不同高压处理的肌球蛋白凝胶傅里叶红外光谱图

Fig.3 FT-IR spectrum of myosin gels with UHP treatment

由图3可见，未超高压处理组在1617cm-1和1638cm-1处有两个大吸收峰，这是蛋白质β-折叠的区域，100MPa处理组在1654cm-1有一大吸收峰，此处是α-螺旋的特征吸收峰，200MPa处理组在1641cm-1有一大吸收峰，在其附近还有1个并列的峰，此处是无规则卷曲的区域，300MPa处理组，在1654cm-1处有一大吸收峰，此处是α-螺旋的特征吸收峰，400MPa和500MPa处理组，都在1647cm-1处有一大吸收峰，此处是无规则卷曲的吸收峰区域。600MPa处理组，在1618cm-1和1637cm-1有两个大的吸收峰，这是蛋白质β-折叠的区域。未超高压处理组和600MPa处理组，蛋白质酰胺Ⅰ带，吸收峰形状相似，但两波数位置不同，都相差1cm-1。这表明传统加热肌球蛋白二级结构与超高压肌球蛋白二级结构不同。

图 4 不同高压处理的肌球蛋白凝胶傅里叶红外光谱二阶导数图

Fig.4 Second derivative FT-IR spectra of myosin gels with UHP treatment at different pressure levels

由图4可见，二阶导数图中，重叠峰和小肩峰被明显分离，总峰数在9～12个之间，符合处理规则。一般蛋白质和多肽的二级结构在红外区有9～12个特征吸收带[19]。观察各种处理的每个峰带，发现蛋白质结构有明显的变化。波数出现红移或者蓝移，或者出现新峰。未超高压处理组凝胶结构有3个大而宽的吸收峰，100～500MPa的凝胶，峰形变小变窄，600MPa凝胶有3个大而宽的吸收峰，大峰上出现一小肩峰。

图 5 不同高压处理的肌球蛋白凝胶高斯拟合图

Fig.5 Gaussian fitting of FT-IR spectra of myosin gels with UHP treatment at different pressure levels

各个压力处理的肌球蛋白高斯拟合图见图5。经过二阶导数，去基线，高斯拟合，得到各个峰的吸收面积，然后计算各二级结构的含量，见表1。未高压处理组蛋白质二级结构以β-折叠为主，其次为β-转角。100MPa预处理后再加热的蛋白质凝胶，β-折叠含量下降5%左右，无规则卷曲含量由14.35%增加为25.81%，β-转角下降（P>0.05）。200MPa预处理后再加热形成的凝胶，β-折叠含量下降2%，无规则卷曲含量升高至29.54%，α-螺旋含量未见明显变化，β-转角含量下降为14.23%。300MPa预处理后再加热形成的凝胶，β-折叠含量下降至47.24%，无规则卷曲含量显著下降至4.63%（P

对各二级结构含量进行多重比较，未高压处理组（即为对照组）、100MPa预处理后再加热组、200MPa预处理后再加热组和300MPa预处理后再加热组的无规则卷曲含量差异显著（P0.05）；500MPa预处理后再加热组、600MPa预处理后再加热组的无规则卷曲含量与对照组差异不显著（P>0.05），与其他组差异显著（P

注：同一列上标不同小写字母表示差异显著（P

对照组与200MPa预处理后再加热组的α-螺旋含量差异不显著（P>0.05），与其他组差异均显著（P

随着压力增大，β-转角含量显著上升。当压力在500MPa时，β-转角的含量极显著升至70.47%（P

超高压处理改变肌球蛋白二级结构的原因是，随着处理压力的增大，肌球蛋白分子间的氢键作用逐渐减小，分子间的相互作用逐渐减弱，其疏水结合及离子结合可能因体积的缩小被切断，导致蛋白质分子展开，非极性基团暴露出来，从而改变了肌球蛋白的二级结构[20]。本研究结合计算机软件二阶导数和高斯拟合的方法定量计算峰面积，最终得到各二级结构的定量信息，与通过拉曼光谱法测定传统加热肌原纤维蛋白凝胶二级结构含量相似[1]。

2.4 蛋白质功能特性与结构相关性分析

由表2相关性分析可知，保水性与β-折叠、无规则卷曲含量极显著正相关（P

3 结 论

不同超高压处理对肌球蛋白凝胶硬度的影响不显著，对凝胶保水性的影响显著，随着压力升高，凝胶保水性逐渐下降。超高压致使肌球蛋白分子结构展开，使蛋白质β-折叠等有序结构减少而β-转角等无序结构增加。从相关性分析结果得出，凝胶的黏附性、弹性、保水性与各二级结构之间存在显著的相关性。

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