超高压液相色谱-串联质谱法(LC-MS-MS)测定鱼肉中磺胺类兽药残留的基质效应

摘 要：采用提取后添加法从提取溶剂、净化方法、同位素内标、基质标曲等方面对超高压液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中的磺胺类兽药残留进行基质效应的研究。结果表明：以乙腈为提取溶剂，经MCX固相萃取柱净化和液液萃取净化可以降低基质效应的影响，采用基质添加标准曲线和同位素内标可以对基质效应的影响进行补偿。

关键词：液相色谱-串联质谱(LC-MS-MS)；鱼肉；磺胺类兽药；基质效应

中图分类号：O657.6 文献标志码：A 文章编号：1001-8123(2013)10-0017-04

液相色谱-质谱联用(LC-MS-MS)技术以其操作简便、准确度和灵敏度高、选择性强等优点成为各种兽药残留的确证方法[1-4]。但复杂样品共提取基质成分和试样前处理引入的外来杂质会严重抑制或增强目标分析物在喷雾接口处的离子化，从而影响到检测的选择性和灵敏度，进而影响到分析结果的准确度和精密度[5-8]。基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰称为基质效应[9-10]。磺胺类兽药的残留检测中存在较强的基质效应，特别是采用LC-MS-MS进行多残留快速筛查[11-12]，但目前的相关研究较少。本研究以鱼肉中磺胺类兽药残留为研究对象，建立超高压液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱法(UPLC-ESI-MS-MS)测定磺胺类兽药残留的方法，利用提取后基质添加法从提取溶剂、净化方法、使用内标等方面进行基质效应的研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鱼肉样品为市售产品；

磺胺脒(胍)、磺胺、磺胺索嘧啶、磺胺醋酰、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯吡嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺多辛、磺胺甲恶唑、磺胺二甲异恶唑、磺胺喹啉、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺硝苯，2种内标(13C6-磺胺甲基嘧啶、D4-磺胺嘧啶) 德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；Cleanert MAS-Q试剂 博纳艾杰尔公司；混合型阳离子交换(MCX)固相萃取柱 美国Waters公司；乙腈、甲醇、正己烷均为色谱纯；甲酸、无水硫酸钠、氯化钠均为分析纯。

1.2 仪器及设备

1290超高压液相色谱仪 美国Agilent公司；API 4000＋串联四级杆质谱仪 美国AB公司；J-E高速冷冻离心机 美国Beckman公司；5418R小型低温离心机 艾本德中国有限公司；氮吹仪 美国Organomation公司；R-205旋转蒸发仪 瑞士Büchi Manschette公司；KQ-500DB型数控超声波清洗器 宁波新芝生物科技股份有限公司；Elix超纯水仪 美国Millipore公司；T18组织匀浆机 德国IKA公司；全自动固相萃取仪 北京普立泰科仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

分别准确称取10mg标准品于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成浓度为1000mg/L的标准储备液，置于－20℃冰箱内避光保存。分别精密吸取上述储备液各适量，置同1容量瓶中，用甲醇-0.1%甲酸水溶液(1:9，m/m)，稀释成质量浓度为1000ng/mL的标准工作溶液，置于

－18℃冰箱内避光保存。

1.3.2 不同溶剂提取方法的比较

称取空白罗非鱼肉5g，匀浆后分别加入20mL甲醇、乙腈、乙酸乙酯作为提取溶剂，10000r/min均质5min，超声5min，加20g无水硫酸钠，4℃条件下10000r/min离心10min，取上清液10mL，40℃条件下氮气吹干后用10mL甲醇-0.1%甲酸水溶液(1:9，m/m)复溶，4℃条件下

13000r/min离心10min，用上清液配制混合标样质量浓度为5.0ng/mL的基质标准溶液。每种溶剂设置3个平行。

1.3.3 不同净化方法的比较

固相萃取净化法参照SN/T 2580―2010《进出口蜂王浆中16种磺胺类药物残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法》[13]，MCX固相萃取柱使用前采用5mL甲醇和5mL水活化，分别取1.3.1节中的5mL待净化液上样。上样后用5mL甲醇-水(1:1，m/m)淋洗，抽干后用5%氨化甲醇5mL洗脱。洗脱液在水浴中氮吹至干，用1mL乙腈-0.1%甲酸溶液(1:4，m/m)复溶，过0.22μm滤膜。配制混合标样质量浓度为5.0ng/mL的基质标准溶液。

液-液萃取法参照GB/T20759―2006《畜禽肉中十六种磺胺类药物残留量的测定 液相色谱-质谱-质谱法》[14]，取5mL 1.3.1节中的待净化液加乙腈饱和的正己烷5mL，旋涡振荡30s，13000r/min离心5min，弃去正己烷层，过0.22μm滤膜。用下层溶液配制混合标样浓度为5.0ng/mL的基质标准溶液。

1.3.4 同位素内标的应用

分别精密吸取1.3.1节中的标准样品工作液适量置容量瓶中，用1.3.3中通过固相萃取净化法及液-液萃取法净化的空白基质溶液做溶剂，配制成质量浓度为0.5、1.0、2.0、10.0ng/mL和50.0ng/mL的混合标准工作液。准确吸取13C6-磺胺甲基嘧啶、D4-磺胺甲基嘧啶和D4-磺胺嘧啶储备液各适量，使其在混合标准工作液中的质量浓度为5.0ng/mL，上机待用。

1.3.5 液相色谱-质谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1mm×100mm，1.8μm)；流动相A为0.1%甲酸水溶液，B相选择乙腈和甲醇进行比较；梯度洗脱程序A相：0～3min、90%～65%，3～10min、65%～40%，10～11min、40%～85%，11～12min、85%～90%，流速0.2mL/min，分析时间12min，柱温30℃，进样量10μL。

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测模(MRM)；雾化电压5500V；离子源温度为600℃；气帘气压力35psi；辅助加热气1压力55psi；辅助加热气2压力65psi；碰撞气压力8psi。

1.3.6 基质效应的评价方法

采用提取后添加法[15]，定量测定1.3.2节和1.3.3节空白基质提取液与纯溶剂中同浓度分析物的离子响应强度，计算2者相对比值来评价基质效应(matrix effect，ME)。计算公式如下：

ME/%＝基质溶液中分析物的峰面积/纯溶剂分析物的峰面积×100

如果比值小于1.0，说明基质对待测物的离子响应产生抑制作用；如果比值大于1.0，说明基质的存在增强了待测物的离子响应强度；如果比值等于1.0，说明待测物应未受影响。

2 结果与分析

2.1 液相色谱-质谱条件的优化

经与Luna 3? C18(150×2.0mm，3μm)和ZORBAX SB C18(2.1mm×100mm，1.8μm)色谱柱相比，ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1mm×100mm，1.8μm)更擅长分离难以分离的碱性化合物，可获得更出色的峰形、柱效和分离度(图1)。同时梯度洗脱可以淋洗进样后的色谱柱, 也可避免前1样品残留的后洗脱物对下1样品的影响，避免基质与目标物产生离子化竞争。质谱离子源中的温度和气流速度会影响离子化效率，可以通过优化软件得到最佳参数。

按照时间顺序，依次为磺胺脒(胍)、磺胺、磺胺醋酰、磺胺索嘧啶、D4-磺胺嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、13C6-磺胺甲基嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺甲恶唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺多辛、磺胺二甲异恶唑、磺胺苯吡唑、磺胺氯吡嗪、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹啉、磺胺硝苯。

2.2 不同提取溶剂对磺胺类兽药残留的基质效应影响

经甲醇、乙腈及乙酸乙酯提取的猪肉基质提取液，添加2ng/mL基质标准溶液进行测定，考察溶剂的种类对目标物峰面积的影响。分析结果表明，提取溶剂种类对猪肉基质中磺胺类药物的信号响应影响较大。经计算，甲醇、乙腈和乙酸乙酯提取猪肉中22种分析物的ME(图2)，分别为13.4%～32.1%、22.1%～47.0%及29.0%～42.1%，由数据可以看出3种溶剂提取物的ME均小于1.0，说明基质对待测物的离子响应均产生抑制作用。其中甲醇提取物的ME最小，说明甲醇提取物基质对目标物离子响应的抑制程度最大。乙腈和乙酸乙酯提取物基质对目标物离子响应的抑制程度次之。

1～22依次为磺胺脒、磺胺、磺胺索嘧啶、磺胺醋酰、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯吡嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺多辛、磺胺甲恶唑、磺胺二甲异恶唑、磺胺喹啉、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺硝苯。

基质效应产生的详细作用机制尚不清楚，但目前认为共提取的基质干扰物与分析物竞争电离是主要原因。本实验选择极性不同的3种溶剂，其中甲醇极性最强，乙酸乙酯极性最弱。根据相似相溶原理，甲醇提取的极性成分相对最多，因此甲醇提取的分析试液中基质干扰成分相对最多，共流出时大大影响了磺胺类药物在电喷雾接口的电离效率，故而其ME最明显；而乙酸乙酯极性较弱，提取的油脂性成分较多，这类物质可以增加喷雾的表面张力，降低了目标物的雾化效率，因而其ME也相对较强。经比较，乙腈且具有沉淀蛋白的作用，极性适中，且有助于提高目标物的电离效率，对基质效应的影响最弱，是提取磺胺类药物的合适溶剂。

2.3 不同净化方法对磺胺类兽药残留的基质效应影响

1～22依次为磺胺脒、磺胺、磺胺索嘧啶、磺胺醋酰、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯吡嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺多辛、磺胺甲恶唑、磺胺二甲异恶唑、磺胺喹啉、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺硝苯。

经乙腈提取的猪肉基质溶液，进一步用MCX固相萃取小柱和液液萃取法净化，滤液分别配制成2ng/mL基质标准溶液进行基质效应考察。从图3可以看出，与净化前相比，两种净化方式都能够有效去除大量基质干扰成分，MCX固相萃取小柱的ME为32.0%～81.2%，液液萃取法的ME为36.0%～78.0%，2者受抑制程度差异不大。MCX小柱为阳离子交换和反相吸附混合型固相萃取柱，在将离子状态的目标物吸附在柱体的同时，去除极性和非极性杂质。液液萃取法是通过正己烷去除非极性的油脂类成分，但由于液液萃取法相对于MCX固相萃取法，没有基质浓缩的过程，因此基质效应的影响较小。从经济实惠和操作复杂程度来看，建议选择液液萃取法用于猪肉中磺胺类兽药残留提取与净化。

2.4 同位素内标物对基质标样的线性、回收率、精密度的校正

取空白罗非鱼肉，添加混合标样浓度为25ng/g，做5个平行实验，采用1.3.2节乙腈提取和1.3.3节液液萃取法净化，计算回收率和精密度。表1中列出的是分别使用外标法和内标法时，标准曲线线性相关系数以及浓。使用外标法时，线性相关系数均为0.99，使用内标法时，除磺胺脒、磺胺和磺胺硝苯外，线性相关系数均可达0.999；使用内标法的回收率明显高于使用外标法的回收率；使用外标法时，精密度为15.0%～23.3%，使用内标法时，精密度为4.7%～11.1%。数据表明使用同位素内标对线性、回收率和精密度进行校正，可获得重复性更好的结果，在很大程度上消除基质效应的影响。同位素内标不但可降低质谱离子化时所产生的基质效应, 还可以消除样品前处理过程中出现的差异。

3 结?论

本研究结果表明，在利用超高压液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中的磺胺类兽药残留时，以乙腈为提取溶剂，经MCX固相萃取柱净化和液液萃取法均可以降低基质效应的影响，从经济实惠和操作复杂程度来看，建议选择液液萃取法用于猪肉中磺胺类兽药残留提取与净化。采用基质添加标准曲线和同位素内标可以对基质效应的影响进行补偿，获得更好的线性相关性、更高的回收率和精密度。

参考文献：

[1] 郭黎明, 朱奎, 江海洋, 等. 超高效液相色谱-串联质谱法同时测定鸡肝中残留的四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物[J]. 色谱, 2009, 27(4): 412-416.

[2] 刘佳佳, 佘永新, 刘洪斌, 等. 高效液相色谱-串联质谱法同时测定动物源性食品中24种磺胺类药物残留[J]. 分析试验室, 2011, 30(2): 9-13.

[3] BARHAM R, BLACK W D, CLAXTON J, et al. Rapid assay for detecting sulfonamidesin tissues of slaughtered animals[J]. Journal of Food Protection, 2001, 64(10): 1565-1573.

[4] 刘岩, 姜宁, 王英峰, 等. 高效液相色谱-电喷雾串联质谱法同时测定鸡肉中残留的磺胺类和氟喹诺酮类兽药[J]. 色谱, 2008, l26(3): 348-352.

[5] MATUSZEWSKI B K. Standard line slopes as a measure of a relative matrix effect in quantitative HPLC-MS bio-analysis[J]. Journal of Chromatography B, 2006, 830: 293-300.

[6] FU I, WOOIF E J, MATUSZEWSKI B K. Effect of the sample matrix on the determination of indinavir in human urine by HPLC with turbo ion spray tandem mass spectrometric detection[J]. Journal of Pharmaceut Biomed, 1998, 18: 347-357.

[7] 贾彦波, 王清清, 宋海峰. 高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS)分析生物样品时的基质效应研究[J]. 军事医学, 2011, 35(2): 149-151.

[8] 刘明艳, 姚志红, 张依, 等. 两种前处理方法对LC-MS-MS测定家兔血清中淫羊藿黄酮类化合物基质效应的影响[J].分析测试学报, 2011, 30(9): 1006-1012.

[9] 任雪冬, 刘成雁, 林雪征. 液相色谱-串联质谱法检测动物源性食品中激素残留所遇到问题的探讨[J]. 理化检验: 化学分册, 2011, 47(7): 872-876.

[10] 向平, 沈敏, 卓先义. 液相色谱-质谱分析中的基质效应[J]. 分析测试学报, 2009, 28(6): 753-756.

[11] 厉文辉, 史亚利, 高立红, 等. 加速溶剂萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时检测鱼肉中喹诺酮、磺胺与大环内酯类抗生素[J]. 分析测试学报, 2010, 29(10): 987-992.

[12] 徐伟东, 秦峰, 李晓雯, 等. 基质固相分散-高压液相色谱-高分辨质谱法测定猪肉中22种磺胺类药物的残留[J]. 食品安全质量检测学报, 2013, 4(1): 141-149.

[13] 中华人民共和国浙江出入境检验检疫局. SN/T 2580―2010 进出口蜂王浆中16种磺胺类药物残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2010.

[14] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会. GB/T20759―2006 畜禽肉中十六种磺胺类药物残留量的测定: 液相色谱-质谱/质谱法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2006.

[15] MATUSZEWSKI B K, CONSTANZER M L, CHAVEZ-ENG C M. Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS-MS[J]. Anal Chem, 2003, 75(13): 3019-3030.