糖肾Ⅰ号对早期糖尿病肾病大鼠的干预及对周期蛋白表达的影响

摘要　目的：观察糖肾Ⅰ号对早期糖尿病肾病大鼠的干预作用及对周期蛋白(PCNA)表达的影响，分析其可能的作用机制，为临床防治糖尿病肾病提供实验依据。方法：通过单侧肾切除合并注射链脲佐茵素(STZ)建立大鼠早期糖尿病肾病模型，随机分为假手术组(S0)、模型组(M)、糖肾Ⅰ号组(TS)、洛汀新即盐酸贝那普利组(B)、糖洛合组(TS+B)各10只。模型成功后给予不同的干预，连续给药8周，末次给药12小时后，采集尿液、血液标本，酶联免疫吸附法(ELISA)检测尿微量白蛋白(UAlb)和p2一微球蛋白(p2一MG)；全自动生化仪检测血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)；摘取右肾，计算肾脏肥大指数(KHI)；免疫组织化学法(IHC)检测肾组织蛋白PCNA的表达。结果：与模型组比较，糖肾Ⅰ号组蛋白排泄量明显减少(P

关键词　糖肾Ⅰ号　周期蛋白　糖尿病肾病　中医药疗法　实验研究

糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见的并发症，也是引起终末期肾病(ESRD)的主要原因之一。如何有效地控制糖尿病肾病的发病率及其进展已成为当今医学界一个关键课题。DN确切发病机制至今仍未完全阐明，治疗亦缺乏有效办法。因此，积极寻找防治DN的有效药物，在DN尚处于早期阶段就给予针对性的防治，对控制和延缓肾脏病的进一步发展具有重要意义。糖肾Ⅰ号是笔者针对DN之气阴两虚、脾肾亏虚、燥热血瘀的复杂病机，结合自己临床多年治疗DN的经验而拟定。近年来我们通过观察糖肾Ⅰ号对早期糖尿病肾病大鼠的生化指标及PCNA表达的影响，探讨其可能的作用机理，以期为临床防治DN提供实验依据。

1　实验材料

1.1 实验动物：SD雄性清洁级大鼠50只，体重(200士20)g，由温州医学院实验动物中心提供。

1.2　实验用药：糖肾Ⅰ号由怀山药、粉葛根、黄芪、芡实、莲须、白术、肉苁蓉、猫人参、山慈姑、漏芦、菝葜、天龙、丹参、黄柏、牛膝等组成，经常规煎煮、过滤、水浴蒸发浓缩至每毫升含相当生药2g，由温州市中医院药剂科提供；洛汀新(盐酸贝那普利，10mg／片)，北京诺华制药有限公司生产，批号：X1036。

1.3　主要试剂：链脲佐菌素(STZ)，美国Sigma公司产品，购于北京博爱科贸有限责任公司，批号：0602010。

2　实验方法

2.1　造模方法：参考徐氏等方法，大鼠正常饮食并适应环境1周，经尿糖、尿蛋白定性检测为阴性后开始实验。随机抽取10只大鼠为假手术组，仅切开大鼠皮层、肌层，暴露肾脏，随后缝合。其余40只大鼠在麻醉下行左侧肾脏切除术，术后恢复2周。将STZ溶于0.2tool/L柠檬酸缓冲液(PH=4.5)中，避光条件下迅速配成浓度为2％的STZ溶液。动物禁食12h后，按照55mg／kg，STZ一次性腹腔注射；72h后，尾静脉取血测定空腹血糖。血糖≥16.7mmol/L，尿量>假手术组的50％作为DN大鼠模型成功标准。

2.2　分组及给药方法：模型成功后随机分为模型组(M)、糖肾I号组(TS)、洛汀新组(B)、糖肾Ⅰ号+洛汀新组(TS+B)、假手术组(SO)，每组10只。大鼠给药剂量按照人与动物体表面积法换算。大鼠药量／kg／d等于成人量／kg／d的6.25倍。糖肾Ⅰ号组：以相当于生药27.08g／kg／d液体量，每日灌胃1次；洛汀新组：以相当于干药18.75mg／kg／d粉末，溶于蒸馏水中，每日灌胃1次；糖洛合组：药物用量、用法同上述两组。假手术组及模型组：给予等量生理盐水。连续给药共8周。实验期间动物自由进食、饮水，不使用胰岛素及其他降糖药物。

2.3　观察指标及方法：具体分述于下。

2.3.1　尿微量白蛋白和β2一微球蛋白测定：代谢笼中收集24h尿液标本，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测。

2.3.2　肾重及肾脏肥大指数：麻醉后，无菌操作，取右肾，去掉被膜，滤纸吸干血迹后称重，并计算肾脏肥大指数(肾重／体重)。

2.3.3　肾功能：酶法及苦味酸法测定Scr、BUN。

2.3.4　免疫组织化学法检测PCNA：右侧肾脏，沿矢状正中线切开，取1/2肾脏中一小块皮质置人4％多聚甲醛固定液中，备行免疫组织化学法观察。方法：石蜡切片，常规脱蜡至水；0.1mol/L枸橼酸缓冲液高压锅抗原修复；3％H2O2室温封闭20min，蒸馏水冲洗；PBS洗，滴加封闭液，37℃，20min；滴加1：75稀释的小鼠抗大鼠单克隆PCNA抗体(武汉博士德生物工程有限公司生产)单抗4℃过夜；PBS洗，滴加非生物素标记的二抗，37℃，30min；PBS洗，DAB显色，苏木素复染，常规酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。PBS代替一抗作阴性对照。

2.4 统计学处理：数据以均数土标准差(z±s)表示，采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。多个样本均数的比较采用单因素方差分析(One-way ANO-VA)，两两比较采用最小显著差法(LSD)。检验水准设为α=0.05，P

3　实验结果

3.1　各组大鼠尿β2-MG和UAlb比较：详见表1。与假手术组比较，模型组尿β2-MG、UAIb均显著增加(P

3.2　各组大鼠右肾重、肾脏肥大指数比较：详见表2。与假手术组比较，模型组和各治疗组肾重、肾脏肥大指数均显著增高(P

3.3　各组大鼠BUN、Scr比较：详见表3。与假手术组比较，模型组和各治疗组Scr、BUN均显著增高(P

3.4　各组大鼠肾脏组织PCNA表达的情况：详见图1、表4。免疫组织化学法染色后，将所制切片在光学显微镜低倍镜下观察细胞核呈现明确的棕黄色颗粒状染色为阳性细胞，细胞核蓝染的细胞为苏木素复染的阴性细胞。在10×20倍高倍镜下，每张标本随机选择5个视野，然后取平均值。免疫组织化学法染色结果采取半定量评分：按染色区变化和染色强度分为0～4分，即O分为无染色或染色极弱；1分为局部弱染、染色区75％。PCNA阳性表达主要在细胞核(详见图1)，假手术组PCNA表达较少，模型组呈强阳性表达，大量细胞核呈棕褐色颗粒状，着色较深，各治疗组表达较少。与假手术组比较，模型组和各治疗组PCNA表达均具有显著性差异(P

4　讨论

糖尿病属于中医“消渴”范畴，糖尿病肾病属于“肾消”范畴，以脾肾亏虚、气阴两虚为病之本，痰瘀互结为病之标，肾络瘀阻贯穿始终。针对本病虚实并见、阴阳并损、本虚标实的病理特点，我们以养阴益气、活血化瘀、清热祛湿立法，组方糖肾Ⅰ号，通过初步临床观察获得较好疗效。糖肾Ⅰ号以怀山药养阴益气，粉葛根生津止渴，黄芪补气升阳，共为君药；猫人参、山慈姑、漏芦、菝葜清热化湿解毒，芡实、莲须固肾收敛，白术、肉苁蓉健脾补肾，共为臣药；天龙、丹参活血化瘀，黄柏清热燥湿为佐药，使补而不滞；牛膝补益肝肾、逐瘀利水、引药下行，为使之用。诸药同用，共奏益气养阴、活血通络、利水泄浊之功。

尿微量蛋白的出现是肾脏早期损伤的标志。其中尿白蛋白升高提示肾小球结构和功能的损害，β2一微球蛋白则是反映肾小管损害非常敏感的指标。本实验结果显示：模型组24小时β2-MG和UAlb定量均显著高于假手术组，提示本实验模型出现肾小球滤过膜结构和功能的改变。与模型组比较，糖肾Ⅰ号组UAlb定量显著降低，由此推断，糖肾Ⅰ号可能通过降低糖尿病肾病模型大鼠的尿蛋白排泄，改善肾脏高灌注、高滤过，从而减轻或延缓基底膜损伤，改善肾小球和肾小管功能。

肾脏肥大是糖尿病肾病出现最早的肾脏病理变化，肾脏肥大指数是衡量肾脏肥大的客观指标，而肾脏肥大是引起肾小球硬化的重要因素。本研究结果表明，模型组大鼠肾脏肥大指数较假手术组明显增加，说明模型大鼠肾脏发生了肥大，符合DN早期病理改变。与模型组相比，糖肾Ⅰ号组肾脏肥大指数显著降低。提示糖肾Ⅰ号通过抑制肾脏肥大，从而起到防治早期DN的作用。BUN和Scr是临床上判定肾功能异常最常用的指标。与模型组对比，糖肾Ⅰ号组血Scr、BUN的含量明显降低，BUN和Scr的浓度可反映肾小球功能，说明该方能明显改善肾功能，增强肾小球对毒性代谢产物的排泄，从而减轻蓄积在体内的毒性物质对各系统脏器功能损害。

PCNA又称增殖细胞核抗原，为DNA聚合酶8的辅助因子，调节DNA的合成，与细胞增殖相关，被认为是评价细胞增殖活性的指标。PCNA表达增加，可促进DNA合成，提示细胞处于增殖状态。从实验结果可见，与假手术组相比，模型组PCNA表达增加，提示糖尿病肾病早期，肾脏细胞处于增殖和肥大状态。与模型组比较，糖肾Ⅰ号组PCNA表达相对较低，提示糖肾Ⅰ号对肾功能的保护作用可能部分是通过抑制PCNA的表达，降低了DNA聚合酶8的活性，从而干扰系膜细胞DNA的合成，阻断细胞进入S期，从而减少早期糖尿病肾病细胞增殖和肥大状态来实现的。本研究证实了糖肾I号具有确切的肾脏保护作用，与洛汀新联合应用治疗本病具有协同作用。