电生理膜片钳技术教学中的一些心得

摘 要 膜片钳技术是电生理学研究中的重要技术，越来越多地被应用于检测细胞离子通道、动作电位、分泌特性等研究中。然而这个系统由于其相对复杂，操作较为难于上手，往往使得没有接受过系统训练的学生比较难使用这一系统获得正确的数据而陷入困境。所以有必要开设课程进行教学。作者对课程中一些须特别注意的环节进行了系统的阐述，以其协助老师们更好地对这门课程进行教学。

关键词 膜片钳技术 电生理学 生物电信号

中图分类号：G424 文献标识码：A

电生理学是生理学的一个分支，是一门研究生物细胞或组织的电学特性的科学。主要研究对象包括细胞膜电势变化、离子通道的性状、跨膜电流的调节以及可兴奋性细胞的动作电位等。电生理学研究中，主要利用物理学的研究方法来探讨生物学问题，最核心的手段就是用膜片钳放大器进行生物电信号的检测。这是一类比较“专家向”的设备，因此必须开设专门的课程对学生进行深入的膜片钳相关技术的教学，使其在科研过程中少走弯路，顺利的开展工作。

膜片钳技术属于物理学和生物学的交叉学科，教学难度较大，在实际教学过程中需要注意一些与传统生命科学课程不同的问题。

1 合理融会多种相关教材

目前在我国发行的膜片钳技术相关教材主要有康华光版、陈军版、刘振伟版三种，各有其不同的侧重点，但都不是非常适合用于膜片钳技术教学课程。康华光版教材侧重于对膜片钳硬件结构的解析，更多的是对膜片钳电路原理方面的描述，比较少地对具体实验内容给出指导，学生容易对诸多的电学原理产生抵触情绪；陈军版教材侧重于生命科学实验教学，比较少涉猎放大器工作原理类内容，也不利于学生对膜片钳技术的深刻理解；刘振伟版教材对硬件相关原理和生命科学实验相关都有比较深入的探讨，但是内容较为繁杂，学生比较难于把握，并且其中掺杂大量类似于Axon公司产品说明书翻译的内容，并不适合所有用户。笔者认为，在实际教学中，可以用陈军版或刘振伟版中宏观的与生命科学具体实验相关的内容为蓝本，添加对实际工作有比较大促进作用的仪器相关知识，如：如何选择合适的反馈电阻、如何排除外界干扰信号等。而对于一些针对特别具体实验的内容，如怎样制备大鼠脑片、怎样进行海马脑片记录、怎样在新生大鼠离体脑干――脊髓标本上进行实验等，则不必列入课程范围内，因为在学生可以查找到的文献中有更新、更完备、更切合实际工作的方法，不需要在课堂上进行这些内容的训练。我们课程的宗旨是让学生理解膜片钳系统的工作原理，并指导其将具体实验与放大器原理结合起来进行科研工作，而非手把手地进行实验方法教学，何况这些教科书上的实验方法很容易被时间所淘汰。至于教材中关于如何连接数模转换线路、如何使用某一种采集软件的内容，也不必列为教学内容。因为这些都是在仪器说明书中所包含的内容，并且随着设备的更新换代会有所改变，学生可以通过阅读说明书来获得更准确的信息。

2 针对学生的特点因材施教

进行膜片钳技术学习的学生绝大多数为理科背景主修生命科学或者医科背景主修医学方面的学生。这些学生的工科知识很薄弱，比较难于理解膜片钳放大器系统是如何进行工作的。因此在教学过程中，不必强求其理解放大器的工作原理，如：膜片钳放大器是如何降低噪声？为什么要采用多阶低通滤波？这些问题比较枯燥，没有接触过电学方面课程的学生容易失去兴趣，只需要他们掌握大致的概念即可，即为什么要滤波，低通滤波的优点和缺点是什么，并用滤波前后的具体数据进行比较。再有比如噪声的分类方式及其计算公式，不必过分深入，只需要学生掌握可以降低噪声的手段即可，如在电极尖端涂覆树脂、减少内液使用量等。但有必要对他们强化跟电生理学测量相关的放大器方面知识，如：P/N漏减（P/N leak substraction）这个知识点，就不可这样一带而过，而是需要明确P/N 漏减功能是怎样实现的？为什么要进行P/N漏减操作？这里需要注意的是，要采用更合适理科背景学生理解的方式进行教学。如果参照传统课本中的模式，先提出P/N漏减的概念，再给出计算方法，最后提出应用范围，往往收不到良好的效果，因为学生已经陷入繁杂的理论体系中。这时应该改换一种模式，首先拿出尚未进行P/N漏减的膜片钳数据如钠离子电流数据和标准的文献中的做比较，再告诉学生，产生这样数据差距的原因，主要是因为线性被动反应电流导致也就是通常所说的漏电流导致的。接下来对P/N漏减模式进行详细解释：给出细胞电生理等效模式图，指出当细胞膜内外电压差发生变化时，细胞作为电路中的等效电阻电容并联体系，其电阻会有电流通过，电容会有充放电反应，也就是产生了电阻电流和电容电流，对于这种电流干扰，是不能简单地通过平移曲线来消除其影响，因此需要引入P/N漏减的方法，在向细胞给出幅度为d阶跃刺激获得实验所需电流数据之前，向细胞施加n个阶跃电压，其电压为d/n，这些较小的阶跃电压可以选择与阶跃刺激方向相同，也可以选择相反，这样将这些阶跃电压所得的被动反应电流加和就可以得到在幅度为d阶跃时候会产生的漏电流，通过曲线间加减法即可消除漏电流的影响。同时，要指出这样做的缺陷――会增大信号的噪声。这样，可以使学生更深刻地理解这一概念，并且懂得在哪种情况下需要采用这个方式进行漏电流剪除，以及P/N漏减操作之后会对数据产生怎样的影响。

3 授课教师应该对膜片钳有深入的理解

膜片钳技术从表面上看只是对膜片钳放大器相关系统的应用来采集微弱的生物电信号，但事实上，对不同的样本，不同类型信号的测量，有非常多的决定成败的细节。这就要求授课教师不能仅仅依赖教材和论文，而要亲身实地尽可能多地涉猎不同类型的实验，才不至于在授课中由于自己的“想当然”而误导学生。如膜片钳的主要测量模式为贴附式、全细胞模式、细胞膜内向外模式、细胞膜外向外模式。曾经很多老师会认为，其中的贴附式是获得数据最简单、技术含量最低的一种，比全细胞模式要容易很多，因为全细胞模式记录是在贴附式记录基础上，吸破细胞和电极接触部分的细胞膜形成的，换句话说进行全细胞模式记录之前先要形成贴附式封接。然而事实并非如此。在膜片钳实验中，一般要求玻璃电极和细胞之间实现高阻抗封接也就是通常说的G欧封接。对于全细胞模式的记录来讲，由于信号较大，全细胞电流一般在数百pA到数千pA，因此达到大约1G欧姆左右的封接，信噪比就足以准确的测定实验信号。所以虽然全细胞模式比贴附式要多一次将封接点细胞膜吸破的工序，但一般而言50%以上的细胞在吸破之后仍然可以保持G欧封接，可以获得有效的数据。而反观贴附式记录模式，一般要测定的是被封接区域上的单通道电流，多在10pA以下，这就需要封接电阻至少要达到10G以上才可以记录到单通道电流。而可以达到10G以上封接的细胞并不特别常见，并且并不是每一次都可以准确地将离子通道封在电极中。因此一般而言，可以说贴附式记录获得实验数据的难度要大于全细胞模式。再比如常见的动作电位的记录。膜片钳教科书上所给出的记录模式图均取自最初的双电极电压钳细胞内记录，即在一根电极处给出短促的方波电压刺激，在另一处电极处处于静息状态下记录细胞的动作电位。但是，其实用这种记录方式来描述常见的动作电位记录是不准确的。目前使用膜片钳系统进行的动作电位记录，大多数是单电极测试，也就是从同一根探头给出去极化刺激并且同时检测膜电流的变化来测定动作电位。这两种情况下，动作电位产生的原理是相同的，可以说反映了类似的细胞活动，但是不能完全等同起来，后者的采集过程中，细胞处于一个较长时间的胞内电势去极化的状态，主要用来测试细胞动作电位的发放频率（Fire rate），而前者主要用来测试细胞对于某种短促刺激的响应能力，这里需要着重给学生分析清楚。

4 指导学生使用合适的科研用分析软件

目前主流的膜片钳设备主要为美国产Axopatch系列和HEKA的EPC系列，两类产品均需要特定的数据处理软件，如前者需要Clampfit，后者需要Igor。这些软件比起常用的办公系列软件来说要复杂很多，比如Igor，其英文说明书就有两千多页，学习起来比较困难。尽管如此，建议老师还是应该精通这些软件并且指导学生用这些专门的科研分析软件进行数据处理和作图，以免发生错误。如膜片钳数据是一个一个数据点排列成的数组，很多时候多达几万甚至几十万个，如果将膜片钳数据导出成数组，用excel来处理，虽然操作较为顺手，但是excel对于单列是有上限的，会直接砍掉一部分数据，造成分析结果异常。并且科研专用分析软件如果运用合理的话，可以按照刊物的需求做出合乎自己需求的图，甚至可以在软件内部编写出可以对数据进行自动化处理的小程序来极大地提高工作效率，而常规办公软件是无法完成这些工作的。

综上所述，电生理膜片钳系统是当今生理学科研中非常重要的系统，但由于其难于精通，所以单单靠日常训练难于让学生正确地利用这个系统进行科研任务。因此，有必要用一系列课程合理地对学生进行培训，切实地分析这一课程与其他传统生理学或者物理学课程的差别，选择合适的方式进行教学，才能使学生更深刻地理解这一系统，来更有效地完成相关科研任务。

参考文献

[1] 陈军.膜片钳实验技术.北京：科学出版社，2001.

[2] 康华光等.膜片钳技术及应用.北京：科学出版社，2003.

[3] 刘振伟.实用膜片钳技术.北京：军事科学出版社，2006.