牛血清白蛋白范文
时间：2023-03-05 09:51:08
牛血清白蛋白范文第1篇
【关键词】 对苯二酚
蛋白质是生物体的基本组成成分，如酶、抗体、转运蛋白等在生物体内发挥着重要功能。人血清白蛋白存在于血液中，分子量为66241，等电点为4?7〔1〕，主要维持血浆的胶体渗透压，其另一功能是与许多微溶于水的物质结合为易溶于水的复合物。酚类化合物对DNA有不同程度的损害〔2-5〕，对苯二酚在环境中容易氧化为对苯二醌，对苯二酚与对苯二醌可以和DNA碱基形成加合物〔6-8〕，对人体危害极大。对苯二酚与对苯二醌是通过人血清白蛋白转运进入人体各器官。因此，研究血清白蛋白与对苯二酚与对苯二醌的相互作用具有重要意义。本文利用循环伏安法研究了对苯二酚在L?半胱氨酸修饰金电极上的电化学行为，并初步探讨了在L?半胱氨酸上牛血清白蛋白与对苯二酚及对苯二醌相互作用的机制。
1 材料与方法
1?1 仪器与试剂 缓冲液：0?05mol/L Na2HPO4-0?05mol/L NaH2PO4-0?10mol/L NaCl缓冲溶液(用NaOH调pH)；0?05g/L L?半胱氨酸；0?1mol/LH2SO4；2?0000g/L对苯二酚。20?0000g/L牛血清白蛋白。MEC-12B型多功能微机电化学分析仪(江苏电分析仪器厂)；金电极(直径1mm)为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。
1?2 实验方法
1?2?1 L?半胱氨酸在金电极上组装 将金电极在置于0?05μmAl2O3粉末中反复抛光至镜面，用Microcloth抛光布抛光光亮，再用丙酮冲洗，用亚沸水超声波清洗。将金电极置于0?1mol/LH2SO4中于2V氧化5s,-0?35～1?5V于1V/s循环扫描5次，取出金电极，用蒸馏水冲洗干净，用磁力搅拌器在蒸馏水中清洗5min，将清洁后的金电极置于50g/L L?半胱氨酸浸泡24h，取出金电极，用蒸馏水冲洗干净，用磁力搅拌器在蒸馏水中清洗5min，即得L?半胱氨酸修饰金电极。所用水为3次亚沸蒸馏水。
1?2?2 电化学行为 在5?00ml容量瓶中，加入0?10ml对苯二酚，5?00ml 0?05mol/L Na2HPO4-0?15mol/L NaCl缓冲溶液，混匀，作循环伏安扫描。
1?3 量子化学计算 对苯二酚与对苯二醌用半经验方法(AM1)进行分子几何构型初始优化，然后用密度泛函理论(DFT)在6-31G(d)水平进行全优化分子结构，在相同水平计算分子的分子前线轨道能量及静电荷。用Gaussian03软件完成所有计算。
2 结果
2?1 L?半胱氨酸修饰电极的电化学行为特征(图1) 由修饰电极于-0?60～0?8V范围内的循环伏安图可见，裸金电极上未见氧化还原峰存在；L?半胱氨酸修饰电极在高电位的电流增大，溶液pH=7?30时，在-0?068V产生一个氧化峰，这可能是羧基在较低的电位下被还原为羟基所致。
2?2 对苯二酚在L半胱氨酸修饰金电极上的电化学行为(图2，表1) 从表1可见，在L?半胱氨酸修饰金电极上，当溶液pH=7?30时，氧化峰(Epa)比裸金电极负移了0?169V，还原峰(Epc)比裸金电极负移了0?061V，对苯二酚在L?半胱氨酸修饰金电极可逆性变好，峰电流变大，对对苯二酚的氧化还原具有催化作用。结果与杜丹等人研究对苯二酚在L?半胱氨酸修饰金电极上的电化学行为一致〔9〕。当溶液pH=11?00时，在L?胱氨酸修饰金电极上的氧化峰比裸金电极正移了0?090V，还原峰比裸金电极负移了0?010V，说明在pH-11?00时，对苯二酚在L?半胱氨酸修饰金电极可逆性变坏，峰电流变小，对对苯二酚的氧化还原不具有催化作用。
表1 对苯二酚在L?半胱氨酸修饰金电极及裸金电极上的电化学参数（略）
2?3 扫速对对苯二酚峰电流和峰电位的影响 对苯二酚在裸金电极上的氧化还原峰电位随着扫速的增大氧化峰电位发生正移，还原峰负移，峰电流(ip)与扫速的平方根(V1/2)成正比，说明峰电流受扩散控制；对苯二酚在L?半胱氨酸修饰金电极上的氧化还原峰电位受扫速的影响与裸金电极相似，峰电流(ip)与扫速的平方根(V1/2)成正比，说明峰电流也受扩散控制。
a,a`:裸金电极；b,b`:L?半胱氨酸修饰电极；扫描速度：100mv/s
图1 L?半胱氨酸修饰金电极上的循环伏安图（略）
a,a`:0?0400g/L对苯二酚在裸金电极上；b,b`:0?0400g/L对苯二酚在L?半胱氨酸修饰电极上；扫描速度：100mv/s
图2 对苯二酚在L?半胱氨酸修饰金电极上和裸金电极上的循环伏安图（略）
2?4 牛血清白蛋白对峰电位与电流的影响(图3) 由于牛血清白蛋白容易吸附到金电极上，故在修饰电极上研究了牛血清白蛋白在pH=7?30溶液中对对苯二酚氧化还原电位及电流的影响。从图3可见，牛血清白蛋白加入到对苯二酚溶液时，其氧化峰电位发生负移，但峰电流改变不大，说明牛血清白蛋白对对苯二酚向电极扩散的影响较小；而对其氧化产物对苯二醌，其氧化峰电位发生负移，峰电流变小，说明牛血清白蛋白对对苯二醌的扩散的影响较大。当牛血清白蛋白的浓度达到0?5000g/L时，峰电位不再改变，说明牛血清白蛋白与对苯二酚结合达到饱和状态。当牛血清白蛋白的浓度达到1?2000g/L时，峰电流不再改变，说明牛血清白蛋白与对苯二醌结合达到饱和状态。根据苯二酚和对苯二醌可以和血清白蛋白结合的饱和度及血清白蛋白的分子量，计算苯二酚和对苯二醌和血清白蛋白结合比分别为48：1和16：1。
a:0?0400g/L对苯二酚;b:0?0400g/L(1?5800g/L)牛血清白蛋白；pH=7?30；扫描速度：100mv/s
图3 牛血清白蛋白对苯二氧化还原电位及电流的影响（略）
2?5 对苯二酚现对苯二醌的量子化学计算结果 对苯二酚与对苯二醌所有原子都在一个平面内，对苯二醌的最大净电荷为0?43，最小的负电荷为-0?45，最低空轨道和最高占有轨道能量分别为-0?12999和-0?27059Hartree,分子的偶极距为0，为非极性分子；分子的净电荷反映了分子间净电吸引的能力；最低空轨道能量越低，越容易接受电子，最高占有轨道能量越高越容易提供电子，分子的前线轨道反映了形成分子氢键的能力，故对苯二酚较对苯二醌容易提供电子，而对苯二醌较对苯二酚容易接受电子。由此来看，对苯二醌比对苯二酚具有较大的净电吸引的能力和形成分子氢键的能力，因而在电极上峰电位和峰电流改变较大。
3 讨论
结果表明，在pH<7?30时主要以NH3-C(R)OO-存在，pH>11?00时主要以NH2-C(R)OO存在。具有较好催化活性的基团为NH3-C(R)OO-。苯酚的pKa1=10?00时，主要以苯酚分子的形式存在，而对苯二酚的羟基是供电子基团，故pKa1<11?00，对苯二酚在水溶液主要以分子形式存在。由于对苯二酚氧原子的电负性较大，因而使羟基和邻近苯环氢具有较低的空轨道，可接受NH3-C(R)OO-氧原子的电子，形成氢键，降低了氧化电位，增大了电流。对苯二醌的氧原子具有更高的净电荷，具最高占有轨道能量更高，最低空轨道能量更低，形成氢键的能力更强。当pH较高时，由于氨基接受氢的能力大于羧基，对苯二醌与L?半胱氨酸形成氢键时，电子的流动性较差，因而电流较小。参照人血清白蛋白等电点为4?7，氨基酸残基如NH3-C(R)OO-存在，牛血清白蛋白对苯二酚和对苯二醌在溶液中的结合，与对苯二酚和对苯二醌在电极上的表现有所差异，对苯二酚和对苯二醌与与对苯二酚和对苯二醌结合后，电极为了破坏这种氢键作用力，必须提供更高的氧化电位和较低的还原电位，这种作用力越强，电位偏离越远，同时强烈的作用将进一步导致复合物扩散系数变小，电流变小。本文结果表明，对苯二醌可以和血清白蛋白形成较强的氢键，且苯二醌和血清白蛋白的作用力要大于对苯二醌的作用力。根据苯二酚和对苯二醌可以和血清白蛋白结合的饱和度及血清白蛋白的分子量计算苯二酚和对苯二醌和血清白蛋白结合比分别为48:1和16:1。
【参考文献】
〔1〕 张昌颖.生物化学［M］.2版.北京：人民卫生出版社，1985：432.
〔2〕 宋远志.对苯二酚与脱氧核糖核酸的相互作用［J］.中国公共卫生，2006，22(2)：192-194.
〔3〕 宋远志.苯酚与脱氧核糖核酸的相互作用［J］.中国公共卫生，2005，21(12)：113-114.
〔4〕 宋远志.对硝基苯酚与杂交中DNA的相互作用［J］.中国公共卫生，2005，21(1)：33-35.
〔5〕 宋远志.邻氨基酚与脱氧核糖核酸的相互作用［J］.中国公共卫生，2005，21(9)：94-96.
〔6〕 Krisztina Pongracz,William J.Bodell.Detection of 3'-Hydroxy-1,N6-benzetheno-2'-deoxyadenosine 3'?Phosphate by 32P Postlabeling of DNA Reacted with p?Benzoquinone［J］.Chem Res Toxicol，1991,4:199-202.
〔7〕 Margaret Gaskell,Rebekah Jukes,Donald J.L.Jones.Identification and Characterization of(3,4-Dihydroxy)-1,N2-benzetheno-2-deoxyguanosine 3-Monophosphate,a Novel DNA Adduct Formed by Benzene Metabolites［J］.Chem Res Toxicol，2002,15:1088-1095.
〔8〕 Margaret Gaskell,Keith I E McLuckie,Peter B.Farmer.Genotoxicity of the benzene metabolites para-benzoquinone and hydroquinone［J］.Chemico-Biological Interactions，2005,153(1):267-270.
牛血清白蛋白范文第2篇
关键词： 邻苯二酚；牛血清白蛋白；循环伏安法；相互作用
A Study on the Interaction between Pyrocatechol，O-Benzoquionone and Bovine Serum Albumen SONG Yuan-zhi1，2，XIE Ji-ming1* ，CHEN Song-tao1，CHEN Min1，WU Yun-long1（1.School of Chemistry & Chemical Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China；2.Jiangsu Province Key Laboratory for Chemistry of Low-Dimensional Materials，Huaiyin Teachers College，Huaian 223300，China）
Abstract：［Objective］ To study the interaction between pyrocatechol，o-benzoquionone and bovine serum albumen. ［Methods］ The cyclic voltammetric（CV）behavior of pyrocatechol and conjoint pyrocatechol with bovine serum albumen at L-cysteine modified golden electrode in 0.05 mol/L Na2HPO4-0.05 mol/L NaH2PO4-0.10 mol/L NaCl buffer solution（pH 7.30）was studied. ［Results］ The peak of conjoint pyrocatechol with bovine serum albumen shifts to positive，the peak of conjoint o-benzoquionone with bovine serum albumen shifts to negative，and its peak current decreases. According to the saturation of respective conjoint pyrocatechol and o-benzoquionone with bovine serum albumen，the conjoint rate of hydroquinone and o-benzoquionone with bovine serum albumen is 71 : 1 and 115 : 1 respectively. ［Conclusion］ The interaction between pyrocatechol and bovine serum albumen is ascribed to hydrogen bonding，and interaction force between o-benzoquionone and bovine serum albumen is bigger than that between pyrocatechol and bovine serum albumen.
Key Words：pyrocatechol；bovine serum albumen；cyclic voltammetric（CV）
蛋白质是生物体的基本组成成分，如酶、抗体、转运蛋白等在生物体内发挥着重要功能。人血清白蛋白存在于血液中，相对分子量为66 241，等电点为4.7［1］，主要维持血浆的胶体渗透压，其另一功能是与许多微溶于水的物质结合为易溶于水的复合物。邻苯二酚广泛用于化工行业，对环境污染极为严重，在环境中容易氧化为邻苯二醌。邻苯二酚与邻苯二醌是通过人血清白蛋白转运进入人体各器官的，可以和DNA碱基形成加合物［2-4］，对人体危害极大。因此，研究血清白蛋白与邻苯二酚及其氧化产物邻苯二醌的相互作用具有重要意义。本项目利用循环伏安法研究邻苯二酚在L-半胱氨酸修饰金电极上的电化学行为，并初步探讨牛血清白蛋白与邻苯二酚及邻苯二醌相互作用的机理。
1内容与方法
1.1仪器与试剂
缓冲液：0.05 mol/L Na2HPO4-0.05 mol/L NaH2PO4-0.10 mol/L NaCl缓冲溶液（用NaOH调pH）；50 g/L L-半胱氨酸；0.1 mol/L H2SO4；2.000 0 g/L邻苯二酚；20.000 0 g/L牛血清白蛋白。
MEC-12B型多功能微机电化学分析仪（江苏电化学分析仪器厂）；金电极（直径1 mm）为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。
1.2实验内容
1.2.1 L-半胱氨酸在金电极上组装
由于L-半胱氨酸金电极制备容易，重现性好，且具有氨基酸基团，可以方便解释氨基酸基团与酚的相互作用，故选择L-半胱氨酸金电极作为工作电极。L-半胱氨酸金电极制备：金电极置于粒径为0.05 μm Al2O3粉末中反复抛光至镜面，再用Microcloth抛光布上抛光光亮，再用丙酮冲洗，用亚沸水超声波清洗。然后将金电极置于H2SO4 0.1 mol/L中2 V氧化5 s，-0.35～1.5 V以1 V/s循环扫描5次，取出金电极，用蒸溜水冲洗干净，用磁力搅拌器在蒸溜水中清洗5 min，将清洁后的金电极置于50 g/L的L-半胱氨酸中浸泡24 h，取出金电极，再用蒸溜水冲洗干净，磁力搅拌器在蒸溜水中清洗5 min，即得L-半胱氨酸修饰金电极。所用水为三次亚沸蒸溜水。
1.2.2电化学行为 在5.00 ml容量瓶中，加入0.10 ml邻苯二酚，5.00 ml 0.05 mol/L Na2HPO4-0.05 mol/L NaH2PO4-0.15 mol/L NaCl缓冲溶液，混匀，作循环伏安扫描。
1.3 量子化学计算
邻苯二酚与邻苯二醌用半经验方法（AM1）进行分子几何构型初始优化，然后用密度泛函理论（DFT）在6～31 G（d）水平进行全优化分子结构，在相同水平计算分子的分子前线轨道能量及静电荷。所有计算在Gaussian 03软件包中完成。
2 结果
2.1 L-半胱氨酸修饰电极的电化学行为特征
修饰电极于-0.60～0.8 V范围内的循环伏安图，裸金电极上未见氧化还原峰存在； L-半胱氨酸修饰电极在低电位的电流减小，在-0.068 V产生一个极小的氧化峰，这可能是羧基在较低的电位下被还原为羟基所致。
2.2 邻苯二酚在L-半胱氨酸修饰金电极上的电化学行为
当溶液酸碱度为pH 7.30时，0.040 0 g/L邻苯二酚在裸金电极（图1a）于100 mV/s循环扫描时产生一个氧化峰（Epa= 0.312 V），峰电流ipa为1.155 μA，于0.012 V产生一个峰电流（ipc）为0.706 μA的还原峰（Epc），ipa/ipc=1.636；在L-半胱氨酸修饰金电极上，氧化峰（Epa）为 0.245 V，比裸金电极负移了0.067 V，峰电流ipa为1.319 μA，于0.085 V产生一个峰电流（ipc）为1.037 μA的还原峰（Epc），比裸金电极正移了0.073 V，ipa/ipc=1.272，说明邻苯二酚在L-半胱氨酸修饰金电极可逆性变好，峰电流变大，对邻苯二酚的氧化还原具有催化作用。
2.3扫速对邻苯二酚峰电流和峰电位的影响
邻苯二酚在裸金电极上的氧化还原峰电位随着扫速的增大氧化峰电位发生正移，还原峰负移，峰电流（ip）与扫速的平方根（V1/2）成正比，说明峰电流受扩散控制；邻苯二酚在L-半胱氨酸修饰金电极上的氧化还原峰电位受扫速的影响与裸金电极相似，但负移的幅度较小，峰电流（ip）与扫速的平方根（V1/2）成正比，说明峰电流也受扩散控制。
2.4 牛血清白蛋白对峰电位与电流的影响
由于牛血清白蛋白容易被吸附到金电极上，故在修饰电极上研究了牛血清白蛋白在pH 7.30溶液中对邻苯二酚氧化还原电位及电流的影响。
从图2可以看出牛血清白蛋白加入到邻苯二酚溶液时，其氧化峰电位发生正移，但峰电流变小，说明牛血清白蛋白对邻苯二酚向电极扩散的影响较大；而对其氧化产物邻苯二醌，其氧化峰电位发生负移，峰电流变小，说明牛血清白蛋白对邻苯二醌的扩散的影响也较大。
图3为牛血清白蛋白与邻苯二酚氧化峰电流的关系，当牛血清白蛋白的质量浓度达到0.340 0 g/L时，峰电流不再改变，说明牛血清白蛋白与邻苯二酚结合达到饱和状态。
图4为牛血清白蛋白与邻苯二醌氧化峰电流的关系，当牛血清白蛋白的质量浓度达到0.2200 g/L时，峰电流不再改变，说明牛血清白蛋白与邻苯二醌结合达到饱和状态。根据苯二酚与邻苯二醌可以和血清白蛋白结合的饱和度及血清白蛋白的分子量计算出苯二酚与邻苯二醌和血清白蛋白的结合比分别为71:1和115:1。
2.5 邻苯二酚与邻苯二醌的量子化学计算结果
邻苯二酚与邻苯二醌所有原子都在一个平面内，邻苯二酚的最大净电荷为0.32，最小的负电荷为-0.26，最低空轨道和最高占有轨道能量分别为0.008 07和-0.206 65 Hartree，分子的偶极距为2.518 7，为极性分子；邻苯二醌的最大净电荷为0.38，最小的负电荷为-0.42，最低空轨道和最高占有轨道能量分别为-0.131 85和-0.249 38 Hartree，分子的偶极距为5.338 1，为极性分子；分子的净电荷反映了分子间净电吸引的能力；最低空轨道能量越低，越容易接受电子，最高占有轨道能量越高越容易提供电子，故分子的前线轨道反映了形成分子氢键的能力。由此来看，邻苯二醌比邻苯二酚具有较大的净电吸引的能力和形成分子氢键的能力，从图4和图5可以看出邻苯二醌在电极上峰电位和峰电流改变较大。
2.6 邻苯二酚、邻苯二醌与血清白蛋白作用机制探讨
L-半胱氨酸的pKa1和pKa2分别为1.96和10.28［5］，当酸碱度为pH 7.30和11.00时，NH3+-C（R）OOH、NH3+-C（R）OO-、NH2 -C（R）OO-的分布分数按下列公式计算：a1=［H+］2/（［H+］2 +ka1［H+］+Ka1Ka2），a2=Ka1［H+］/（［H+］2+ka1［H+］+Ka1Ka2），a3=Ka1Ka2/（［H+］2+ka1［H+］+Ka1Ka2），pH 7.30，a1=0.000，a2= 1.000，a3=0.000
可见，在pH < 7.30时主要以NH3+-C（R）OO-存在。具有较好催化活性的基团为NH3+-C（R）OO-。苯酚的pKa1 = 10.00，pH < 11.00时，主要以苯酚分子的形式存在，邻苯二酚是供电子基团，pKa1 < 11.00，邻苯二酚在水溶液中主要以分子形式存在。由于邻苯二酚氧原子的电负性较大，因而使羟基和邻近苯环氢具有较低的空轨道，可接受NH3+-C（R）OO-氧原子的电子，形成氢键，降低了氧化电位，降低了还原电位，增大了电流。L-半胱氨酸对邻苯二酚的催化分子结构见图5a。邻苯二醌的氧原子具有更高的净电荷，且最高占有轨道能量更高，最低空轨道能量更低，形成氢键的能力更强。L-半胱氨酸对邻苯二醌的催化分子结构见图5b。
3 讨论
人血清白蛋白是由氨基酸组成的生物大分子，其表面有大量的氨基酸残基，与L-半胱氨酸具有相似的结合方式。参照人血清白蛋白等电点为4.7，氨基酸残基主要以NH3+-C（R）OO-存在，牛血清白蛋白与邻苯二酚和邻苯二醌在溶液中的结合，与邻苯二酚和邻苯二醌在电极上的表现有所差异，邻苯二酚和邻苯二醌与血清白蛋白结合后，电极为了破坏这种氢键作用力，必须提供更高的氧化电位和较低的还原电位，这种作用力越强，电位偏离越远，同时强烈的作用将进一步导致复合物扩散系数变小，电流变小。本研究结果表明邻苯二醌与牛血清白蛋白的结合力强于邻苯二酚。
量子化学计算和电化学结果表明，邻苯二酚和邻苯二醌可以和血清白蛋白形成较强的氢键，且邻苯二醌和血清白蛋白的作用力要大于邻苯二酚的作用力。根据邻苯二酚和邻苯二醌可以和血清白蛋白结合的饱和度及血清白蛋白的分子量计算邻苯二酚、邻苯二醌与血清白蛋白结合比分别为71 : 1和115 : 1。
参考文献：
张昌颖.生物化学［M］.第2版.北京：人民卫生出版社，1985：432.
PONGRACZ K，BODELL W J. Detection of 3'-Hydroxy-l，N6- benzetheno-2'- deoxyadenosine 3'-Phosphate by 32P Postlabeling of DNA Reacted with p-benzoquinone［J］. Chem Re Toxicol，1991，4：199-202.
GASKELL M，JUKES R，JONES D J. Identification and characterization of（3，4-Dihydroxy）-1，N2-benzetheno-2-deoxyguanosine 3- monophosphate，a novel DNA adduct formed by benzene metabolites［J］. Chem Re Toxicol，2002，15：1088-1095.
GASKELL M，MCLUCKIE K I，FARMER P B. Genotoxicity of the benzene metabolites para-benzoquinone and hydroquinone［J］. Chem-Biol Interact，2005，30，153-154：267-270.
张昌颖.生物化学［M］.第2版.北京：人民卫生出版社，1985：15.
（收稿日期：2006-06-02）
牛血清白蛋白范文第3篇
【关键词】荧光光谱法 可卡因 牛血清蛋白 相互作用
【Abstract】Objective To study the interaction of bovine serum albumin（BSA） with cocaine at different temperature and mechanisms underlying.Methods The quenching of fluorescence was determined by measuring fluorescence quenching spectra and synchronous fluorescence spectra of BSA interacted with cocaine.The type of binding foece was estimated according to the themodynamic equation.Results The fluorescence of BSA interacted with cocaine was quenched regularly .The values of binding constants（Ks）to be 1.38×103 L/mol （30℃），and6.19×103 L/mol （37℃），amounts of binding sites（1），and themodynamic parameters（ΔH： 167.44 KJ/mol，ΔS： 612.71J/mol・K ，ΔG： -18.21 KJ/mol（30℃）and-22.50（37℃））were obtained by analyzing and processing the fluorescence quenching data according to Stern-Volmer equation， Lineweaver-Burk equation and themodynamic equation，respectively.Conclusion It was shown that the fluorescence quenching process of BSA with Cocaine was attributed to static quenching. The force of the reaction was mainly due to hydrophobic action.
【Keywords】Fluoro-spectroscopy； Cocaine；Bovine serum albumin；Interaction
可卡因 （ cocaine） 化学名为苯甲酰甲基芽子碱 ，又称古柯生物碱。导致其滥用的主要原因是其强烈的中枢神经系统兴奋作用（ 欣） [1]。可卡因的滥用可导致机体多个系统、脏器的损伤[2]，严重者可诱发心律紊乱、全身抽搐、呼吸衰竭而致死。对于长期小剂量滥用所致的慢性中毒，主要是心理依赖性反应， 生理依赖很轻[3]。
血清白蛋白是人和动物血清中含量最丰富的一种蛋白质，与各种带正电荷的物质及电中性物质均有一定程度的相互作用。各类药物进入人体首先与血清白蛋白结合，通过血浆的存贮和运输，到达受体部位产生药理作用[4]。研究各种药物与血清白蛋白的结合，来获取药物分子对蛋白质分子构象的影响以及药物的药理等有用信息，已经引起了生命科学、化学、药学及临床医学科研工作者的普遍关注。目前研究生物大分子与药物小分子相互作用的方法主要有荧光光谱法[5]、紫外光谱法[6]、圆二色谱法[7]、拉曼光谱法[8]、电化学法[9]和核磁共振法[10]等。
荧光光谱法是研究生物大分子与药物小分子化合物之间相互作用很有效的方法，发射峰的位置、荧光偏振、能量转移、荧光寿命等指标均可以对蛋白质中荧光发色团的结构及其所处的微环境提供有用的数据信息[11]。
本文采用荧光光谱法，在模拟生理条件下，定性研究可卡因与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用机理，分析其作用力类型，确定其结合常数和结合位点数，再通过同步荧光法确定可卡因对BSA构象的影响方式，进而分析可卡因对人体的作用和运转代谢情况，获得蛋白质分子的构象及其变化和可卡因的药理效应等信息。
1实验部分
1.1仪器与试剂
1.1.1仪器
Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer型荧光分光光度计（Aglient Technologies）；FA1104N电子分析天平（上海恒平科学仪器有限公司）；HH-2数显恒温水浴锅（上海叶拓仪表有限公司）。
1.1.2试剂
牛血清白蛋白（BR，国药集团化学试剂有限公司）；盐酸可卡因（BR，公安部物证鉴定中心）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）（BR，国药集团化学试剂有限公司）；盐酸（HCl）（AR，上海久亿化学试剂有限公司）；氯化钠（NaCl）（AR，西陇化工股份有限公司）。
1.1.3溶液配置
牛血清白蛋白（BSA）标准储备溶液：准确称取纯度大于99%的牛血清白蛋白0.335g于50ml容量瓶中，以pH =7.4的0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸缓冲液（其中含0.1mol/L NaCl维持离子强度）定容为50ml，浓度为1.0×10-4mol/L，低温（≤4℃）保存于冰箱。
可卡因标准储备溶液：用电子天平准确称取4mg标准品于100ml的容量瓶中，以pH =7.4的 Tris-HCl缓冲液（其中含0.1mol/L NaCl维持离子强度）溶解并定容，浓度为40.0μg/mL，低温（≤4℃）保存于冰箱。
实验时所需浓度由Tris-HCl缓冲溶液（ pH =7.4，内含0.1mol/L NaCl维持离子强度）稀释而得。所用试剂均为分析纯，实验用水为怡宝纯净水。
1.2实验方法
于编号为 0-7的4mL离心管中分别加入2mL 1.0×10-4mol/L的BSA溶液， 使用移液枪分别加入的40mg/L 盐酸可卡因工作液0、10、20、30、40、50、60、70 μL，充分摇匀，并分别在T=30℃和T=37℃的条件下恒温水浴1h 。采用1cm石英比色皿，选择激发波长为292.03 nm ，狭缝宽度均为5nm ，光电管负高压为400V，扫描速率1200nm/min，扫描并绘制300-500 nm 的荧光光谱，以及固定荧光激发与发射的波长差λ=15nm和λ=60nm的同步荧光光谱。
2结果与讨论
2.1 荧光猝灭光谱
按照实验方法分别测定了30℃、37℃ 温度下不同浓度的可卡因对牛血清白蛋白的荧光猝灭光谱，30℃ 时的猝灭光谱见图1。由图1可知，随着可卡因浓度的逐渐增加，牛血清白蛋白的荧光特征峰逐渐降低。这是由于BSA中存在的色氨酸和酪氨酸，使其具有内源荧光[12]，当固定BSA的量而不断增加可卡因的浓度时，可卡因与BSA之间的相互作用导致BSA内源荧光强度有规律性的猝灭。
2.2 荧光猝灭机理及猝灭常数的测定
引起BSA荧光猝灭的原因可能有动态猝灭和静态猝灭两种。动态猝灭过程遵循 Stern-Volmer 方程[13]：
F0/F = 1 + Ksv[Q] = 1 + Kqτ0[ Q ] （1）
式中，F0和F表示不存在和存在猝灭剂时荧光物质的荧光强度，[Q]为猝灭剂的浓度， Ksv为动态猝灭常数（又称为 Stern-Volmer 猝灭常数）， Kq 是由扩散过程控制的双分子动态猝灭速率常数。τ0为没有猝灭剂存在下荧光分子平均寿命，生物大分子荧光寿命约为10-8s[14]。
静态猝灭过程遵循下式：
F0/F = 1 + Ks[Q] （2）
式中，Ks是静态猝灭常数（即配合物的缔合常数）。随温度升高动态猝灭常数增大，而静态猝灭常数减小，可由此判断荧光猝灭类型。
以F0/F对相应的[Q]作图，得到可卡因对BSA之间猝灭的 Stern-Volmer 曲线，继而得到不同温度下可卡因对BSA荧光猝灭的 Stern-Volmer 方程。由 Stern-Volmer 方程得到在30℃和37℃时 Ksv分别为：Ksv30 =2.1162×104 ； Ksv37 =1.3099×104 。
由于生物大分子的荧光寿命约为10-8s，由方程：
Ksv = Kqτ0 （3）
可以得到不同温度下的可卡因和BSA之间猝灭过程的速率常数 Kq数量级均为1012。Kq大于各类猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭速率常数2.0×1010 L/mol？S[15]，所以加入可卡因导致BSA荧光猝灭不是由动态碰撞引起的，可以初步判断猝灭过程是以静态猝灭为主，而随温度升高，Stern-Volmer 方程的斜率（即动态猝灭常数）逐渐减小，进一步表明猝灭过程是以静态猝灭为主。
2.3 结合常数及结合点数的测定
当小分子与大分子结合时，其表观结合常数K与结合位点数n可由下式求得[16]：
K + n （4）
式中：K为结合常数；n为结合点数。
对30℃和37℃时的lg[（Fo-F）/F]-1-lg[Q]-1作双对数图，如图3。
根据截距和斜率求得不同温度下的结合常数K和结合点数n（见表1）。由表可知在实验条件下结合位点数n接近1，说明盐酸可卡因与BSA可形成1个结合点数。而在30℃和37℃时的K值处于同一数量级，则更加印证了可卡因对BSA的猝灭方式为静态猝灭。
2.4 BSA与可卡因结合反应的热力学参数和作用力的确定
分子间的作用力包括氢键、范德华力、静电引力、疏水作用力等4种。当温度变化不大时，反应的焓变ΔH可认为是常数。根据反应前后的热力学参数焓变H和熵变S的相对大小， 可以确定分子间的相互作用力类型： 当H0时为疏水作用力[5]。由热力学公式： （5） （6） （7）
结合K，分别计算出不同温度时可卡因与BSA作用的自由能变ΔG、焓变ΔH和熵变ΔS（结果见表2），可得30℃，37℃时的可卡因和BSA的热力学参数ΔH均为167.44KJ/mol，自由能变（ΔG）分别为-18.21，-22.50KJ/mol，ΔS均为612.71J/mol・K。
根据Ross等总结出的判断生物大分子与小分子结合力性质和生物大分子自身结合力性质的热力学规律[17]，推断出可卡因与BSA之间的作用力以疏水作用力为主。
2.5 同步荧光光谱
对于蛋白质的同光荧光光谱，λ=15nm时仅表现为酪氨酸残基的荧光，λ=60nm时则显示色氨酸残基的荧光。因芳香族氨基酸残基的最大发射波长与所处环境极性有关，若其最大发射波长改变，说明残基所处的微环境发生了改变，由发射波长的改变可判断BSA中芳香氨基酸残基所处微环境的变化[12]。
由λ为15nm和60nm的同步荧光光谱（如图4）可知，酪氨酸残基和色氨酸残基的特征荧光光谱峰均随可卡因浓度的增加而产生猝灭，但对酪氨酸和色氨酸特征峰的位置影响不大，表明可卡因对牛血清蛋白构象的改变不大[18]。相比之下，色氨酸残基荧光猝灭程度比酪氨酸残基更显著，表明结合位点更接近于色氨酸残基。
在可卡因与牛血清白蛋白相互作用的过程中，随可卡因浓度升高，牛血清白蛋白的荧光强度呈有规律下降。在可卡因对牛血清白蛋白的荧光猝灭过程中，随温度升高，猝灭常数降低，猝灭方式为静态猝灭。两者以物质的量比1：1结合，作用力类型为疏水作用力；同步荧光扫描结果显示，可卡因对牛血清白蛋白的构象影响不大，两者的结合点可能位于色氨酸上。
3 结语
本文采用荧光光谱法研究可卡因与牛血清白蛋白之间的相互作用。结果表明：可卡因对BSA的荧光猝灭为静态猝灭，两者相互作用的结合常数K分别为1.38×103 L/mol （30℃）和6.19×103 L/mol （37℃）、结合位点数n为1、热力学参数ΔH、ΔS、ΔG分别为167.44KJ/mol、612.71J/mol・K、-18.21 KJ/mol（30℃）和-22.50 KJ/mol（37℃）。根据分子间相互作用力和热力学参数间的关系，可推断两者的相互作用力主要是疏水作用力。从同步荧光光谱法可知：由于两者之间的反应，BSA的荧光强度显著降低，并推测可卡因和BSA的结合点位于色氨酸残基上。
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牛血清白蛋白范文第4篇
（PLS-DA）的方法，观察2组大鼠尿液的代谢轮廓差异，筛选出差异代谢物。模型组和对照组的代谢谱图存在明显差异，并筛选出与过敏反应相关的14个差异代谢物，4条主要代谢通路。该文建立了基于UPLC-Q-TOF-MS技术进行牛血清白蛋白诱导过敏反应的大鼠尿液代谢组学研究方法，推测牛血清白蛋白诱导过敏反应的作用机制可能涉及异黄酮、叶酸的生物合成，色氨酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢等过程，为进一步探索代谢组学在药物过敏反应研究中的应用奠定了基础。
[关键词]牛血清白蛋白； 生物标志物； 代谢组学； 过敏反应
[Abstract]The metabonomic techniques were used to study the changes in endogenous metabolites between urines of rats in normal physiological conditions and bovine serum albumin induced allergic reactions， identify potential biomarkers associated with allergic reactions， and then analyze the metabolic pathways and the metabolic mechanisms of allergic reactions. The bovine serum albumin-induced allergic reactions in rats were adopted as a model to detect histamine and tryptase in rat serum and observe the issue morphology of lungs and trachea in rats. UPLC-Q-TOF-MS was applied in metabonomic analysis on urines between control group and allergic reaction model group. Principal component analysis（PCA） and partial least squares discriminant analysis（PLS-DA） were applied to observe the differences in metabolic profiling between urines of the two groups and select differential metabolites. There were significant differences in metabolism spectrum between the model group and the control group. Totally 14 differential metabolites and 4 major metabolic pathways were screened out. The metabonomic research method for urines of rats with bovine serum albumin-induced allergic reactions based on UPLC-Q-TOF-MS was established in this study. It was speculated that the mechanism of bovine serum albumin-induced allergic reactions may involve biosynthesis of isoflavone and folic acid and metabolism of tryptophan， nicotinic acid and nicotinamide. It lays a foundation for further exploration of the application of metabolomics in drug allergy reaction studies.
[Key words]bovine serum albumin； biomarker； metabolomics； allergic reaction
doi：10.4268/cjcmm20162123
^敏反应又称变态反应，是指机体受同一抗原再次刺激后产生的一种异常或病理性免疫反应，主要表现为生理功能紊乱和组织损伤。过敏反应是临床常见的不良反应，大多数药物都有可能引起过敏反应，严重影响人类的健康，其危害不容忽视。随着新药涌现、药物的不合理应用等原因，药物过敏反应发生率一直居高不下。尤其是中药注射剂在临床的广泛应用，其不良反应（ADR）报道也逐年增加，尤以过敏反应事件较多。然而过敏反应机制并未完全明确[1-3]。
代谢组学是一种后基因时代的全新组学技术，以生物体内低相对分子质量物质的动态规律变化。是从整体观出发，以机体代谢组学变化为载体，以时空动态性和全局性观点，全面解析疾病对机体的影响[4-6]。
本试验应用代谢组学技术，以牛血清白蛋白诱导大鼠产生过敏反应动物模型为研究对象，分析过敏反应引起的机体代谢状态和内源性小分子代谢物的变化，通过比较这些代谢物的变化情况，寻找与过敏反应密切相关的生物标记物和代谢通路，进而探讨过敏反应的代谢机制，为中药注射剂的临床安全应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 美国Waters AcquityTM UPLC液相色谱仪（包括四元梯度泵，在线真空脱气机，自动进样器，二极管阵列检测器，柱温箱）；美国Micromass Q-TOF microTM四极杆-飞行时间质谱（电喷雾离子源-正、负离子扫描方法-Lockspray）；色谱柱为ACQUITY UPLCTM BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，Waters Corp，Milford USA）；KDC-160 HR高速冷冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；酶标仪（赛默飞世尔中国上海仪器有限公司）；超低温冰箱（Thermo）；KQ5200 E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；JA 2003精密电子天平（上海良平仪器厂）。
牛血清白蛋白BSA（美国，Sigma公司）；0.9%氯化纳注射液（中国浙江都邦药业股份有限公司）；大鼠血清组胺检测试剂盒（中国上海蓝基生物科技有限公司）；胰蛋白（中国北京索莱宝科技有限公司）；色谱级乙腈（美国Fisher公司），屈臣氏蒸馏水（中国广州屈臣氏食品有限公司），色谱级甲酸（中国天津科密欧化学试剂有限公司），亮氨酸-脑啡肽（美国Sigma公司）。
1.2 动物分组与造模 健康SD雄性大鼠（SPF级），体重（200±20） g，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供，动物使用编号SYXK（黑）2013-012。给予标准饲料和饮用水，且控制室内温度为（22±1） ℃、相对湿度40%～50%。12 h蔽光，12 h光照，自由饮水饮食，每只大鼠单独代谢笼正常饲养适应1周后开始试验。
16只大鼠随机分为空白对照组和模型组，大鼠腹腔注射致敏，隔日1次，连续注射3次。于首次致敏后第14天和第21天对大鼠进行尾静脉注射激发给药，对照组给予同样体积的0.9%氯化钠注射液，即刻至30 min观察大鼠出现的体征表现。每组给药情况为空白对照组：致敏给予生理盐水1.0 mL/只，激发给予生理盐水2.0 mL/只；模型组：致敏给予0.6%的BSA，1.0 mL/只，激发给予2.4%的BSA，2.0 mL/只[7-8]。
1.3 生化指标检测 按大鼠Histamine ELISA检测试剂盒说明书进行操作，检测大鼠血清组胺含量。采用专属性底物法检测类胰蛋白酶。
1.4 组织病理学检查 于最后一次收集完尿液，将大鼠麻醉，取固定部位肺和气管组织，置于4%多聚甲醛液中固定，常规脱水透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色、脱水、透明、封片，普通光学显微镜下观察病理组织学改变。
1.5 样本的预处理与UPLC-Q-TOF-MS分析条件[9-11] 于每次给药第2天7：00―8：00收集每只大鼠12 h内的尿样，13 000 r・min-1（4 ℃）离心15 min，过0.22 μm微孔滤膜后进蛹觳狻514天和第21天给药激发后30 min于眼静脉丛采血，室温放置30 min，3 000 r・min-1离心15 min，分离血清，置于-80 ℃冰箱中保存备用。
色谱条件：ACQUITY UPLCTM BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，Waters Corp，Milford USA）；流动相A为乙腈，B为0.1%甲酸水，梯度洗脱，0～8 min，2%～40% A，8～10 min，40%～98% A，10～13 min，98%～100% A；柱温40 ℃；流速0.3 mL・min-1。
质谱条件：美国Micromass Q-TOF microTM四极杆-飞行时间质谱系统，电喷雾电离源（ESI），采用正负离子扫描检测；脱溶剂温度为350 ℃，锥孔流速为20 L・h-1；毛细管电压正离子扫描为 1 300 V，负离子扫描为 1 500 V；样品锥孔电压60 V；提取锥孔电压5.0 V；离子源温度为110 ℃；碰撞能30 V；碰撞气为氩气；准确质量校正采用亮氨酸-脑啡肽溶液（556.277 1[M+H]+，554.261 5[M-H]-），扫描范围m/z 100～1 500。
1.6 数据处理 目前，代谢组学海量数据处理是通过现代化学信息学和生物统计学领域的新方法对获得的多维复杂数据进行降维和信息挖掘[12]。将空白对照组和模型组大鼠尿液代谢轮廓数据导入Markerlynx软件进行色谱峰识别以及峰匹配，并采用PCA对获得的多维复杂数据进行降维处理，同时采用偏最小二乘-判别分析（PLS-DA）方法对获得的复杂数据进行统计分析。对差异性代谢物进行二级质谱分析，解析生物标志物及相关的代谢通路。
2 结果
2.1 宏观体征 在3次致敏过程中模型组大鼠与空白对照组的一般情况无明显差异，尾静脉激发给药后，模型组大鼠均出现了明显的精神萎糜、活动减少、哮喘、痉挛等过敏反应症状，但无动物死亡；而空白对照组大鼠无明显的过敏反应症状。
2.2 生化指标和病理切片 与空白对照组进行比较，模型组大鼠组胺和类胰蛋白酶含量增加，且均具有显著性差异（P
细胞层完整，固有层可见胶原纤维和弹性纤维，可见血管、淋巴管以及淋巴组织。软骨环完整。模型组气管黏膜层和黏膜下层增厚，大部分假复层纤毛上皮细胞和固有层消失，细胞嗜碱性增强，见图1。
空白对照组肺组织结构完好；模型组肺动脉血管见有扩张淤血，大部分肺泡组织不张，肺泡隔增厚，有散在的炎细胞，见图2。
2.3 大鼠尿液UPLC-TOF-MS代谢轮廓和整体表征 2组大鼠第2次激发给药后12 h尿液代谢产物利用ESI正离子模式分别采集对照组和模型组大鼠尿液样本数据，得到尿液样本的BPI图。在优化的分析条件下，正负离子扫描模式13 min的有效洗脱时间内获得较好的分离和响应效果，结果见图3，4。
2.4 数据分析 对尾静脉第2次激发后12 h大鼠尿液进行检测分析，用Markerlyns XS软件进行数据降维和质谱矩阵信息的获取，进行Pareto模式的PCA，采用OPLS-DA对2组尿液代谢物组进行分析，得到反应组间变化的Scores plot，见图5，6。在正、负离子扫描模式下，2组聚类分组明显，代谢物表型差异显著，表明模型组内源性代谢物的含量发生了很大变化，说明给予牛血清白蛋白后大鼠正常生理代谢紊乱，从代谢物组变化的角度可证明牛血清白蛋白诱导过敏反应模型造模成功。
2.5 表征过敏反应标志物的筛选及结构鉴定 对空白组和模型组大鼠尿液进行OPLS-DA分析，对VIP>2的差异变量进行色谱峰提取并积分，进行非参数t检验，筛选P
3 讨论
经前期试验摸索，从宏观体征、生化指标和肺、气管的病理指标判断，过敏反应动物模型造模成功，本研究进一步运用代谢组学方法结合UPLC-MS分析技术，研究过敏反应大鼠尿液中小分子内源性代谢物的变化规律，并筛选出贡献大的且有差异的特征性标志物，初步判定14个生物标记物[13]，在对这些标记物的研究发现15-oxo-lipoxin A4是脂氧素衍生物。脂氧素（LXS）和阿司匹林触发脂氧素（ATL）是由花生四烯酸产生的促炎脂质衍生的介质，在结构、形式和功能上区别于许多其他促炎脂质衍生的介质[14]。脂氧素A4（LXA4）引发细胞反应，并通过激活特异受体ALX调节白细胞在体内的运输，通^花生四烯酸（AA2）衍生的类二十烷酸，包括前列腺素（PG）和白三烯（LTs），对发挥局部免疫过敏和炎症反应具有重要作用。在本次试验中发现模型组5-氧代脂氧素A4有增加趋势，表明大鼠体内5-氧代脂氧素A4代谢发生紊乱，推测大鼠可能产生免疫应激反应，在过敏反应发生的同时，也伴随着炎症的产生。
7，8-dihydroneopterin是通过用γ干扰素在刺激人单核细胞衍生的巨噬细胞产生，曾在病毒感染和自身免疫性疾病人体体液中发现。该试验模型组大鼠尿液中7，8-dihydroneopterin有上调趋势，推测大鼠可能产生免疫应激反应。
3-methyldioxyindole是乙醛脱氢酶的一个代谢物，在代谢中形成，是主要的尿代谢物。有学者认为，3-甲基吲哚的体内氧化产物是色氨酸的代谢产物，通过在结肠中的细菌产生的[15]。
4，6-dihydroxyquinoline是在单胺氧化酶的作用下转化而来，是5-羟色氨酸的代谢通路转化而来，5-羟色氨酸是5-羟色胺的前体物质，查阅文献[13]发现5-羟色胺能促进下丘脑释放神经递质的作用，故说明下丘脑神经递质的分泌被抑制。
pterin涉及到叶酸的生物合成通路，在此通路中pterin因主要合成叶酸而呈下调趋势。叶酸的抗氧化应激作用引起活性氧化基因（自由基、过氧化物等）的产生和抗氧化防御之间的失衡。最近有报道发现，过敏性反应和氧化应激分子存在十分重要的关系。过敏性反应时，肥大细胞激活后，刺激免疫系统（immune system），可以激活肥大细胞的活性氧（ROS），体内产生的有害物质，并通常作为氧化剂。
综上所述，本试验通过对特征性生物标志物进行分析，发现并鉴定了14个潜在生物标志物，并且呈现一定的上调或下调趋势，这些生物标志物主要与异黄酮、叶酸的生物合成，色氨酸、烟酸和烟酰胺的代谢等通路相关。通过对所述标志物的代谢轨迹变化，探讨过敏反应的产生、发展过程，进而从机体代谢通路异常来初步了解牛血清白蛋白诱导过敏反应的代谢机制。下一步笔者将对其他生物标志物与过敏反应的具体联系进行深入研究，为避免药物的过敏反应提供理论支持。
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牛血清白蛋白范文第5篇
[关键词] 磷钨杂多酸；牛血清白蛋白；荧光光谱；紫外光谱；同步荧光
[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）10（b）-0062-03
多酸化合物是通过具有d0、d1构型的金属阳离子以氧阴离子为桥进行自由组装而形成的低聚化合物。按照所含无机含氧酸根离子的同种与否，可分为同多酸和杂多酸，其中杂多酸已被广泛应用在功能材料、催化、相转移等多个领域，近年来，杂多酸在抗艾滋病、抗肿瘤和抗病毒方面也取得了令人瞩目的成就[1]。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）能与血浆中的内源性和外源性物质结合，起到转运和存储药物的作用，研究多酸化合物与白蛋白的相互作用，在分析化学、生物化学和医学领域都具有重要的理论研究与参考价值。曾有文献研究了磷钨酸与BSA的结合平衡[2]，为研究磷钨杂多酸与牛血清白蛋白的相互作用，本文比较了不同温度下磷钨杂多酸与BSA的相互作用，讨论了其作用机制，并采用同步荧光光谱法研究了磷钨酸对BSA构象的影响，以期为进一步研究多酸药物的作用机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 仪器与试药
仪器：UV-2100紫外分光光度计（Shimadzu，日本），F-5301PC型荧光分光光度计（Shimadzu，日本），pH计（赛多利斯，德国），恒温水浴锅（国华电器）。
试药：BSA，用Tris缓冲溶液（0.1 mol/L，pH=7.4，内含0.1 mol/L NaCl）制成含BSA 2.0×10-5 mol/L的储备液，置冰箱中5℃低温保存；磷钨酸（H4[PW12O40]，国药集团）制成浓度约为3.2×10-6 mol/L的储备液。除Tris为生化试剂外，其余试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。
1.2 实验方法
1.2.1 磷钨杂多酸与BSA作用的荧光光谱测定 移取3 ml 2.0×10-5 mol/L的BSA于一系列5 ml离心管中，用微量进样器分别加入0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0 μl 3.2×10-6 mol/L的磷钨酸溶液，混匀，静置30 min后，固定λex=280 nm，测定在220～550 nm波长范围内的发射光谱。
1.2.2 磷钨杂多酸与BSA作用的紫外吸收光谱测定 分别测定浓度为3.2×10-6 mol/L的磷钨杂多酸、BSA以及磷钨杂多酸与BSA混合溶液（比例为1∶1）的紫外吸收光谱。
1.2.3 磷钨杂多酸与BSA作用的同步荧光光谱测定 采用“1.2.1”所配制的溶液在温度为298K条件下静置30 min，固定发射与激发的波长差分别为Δλ=60 nm和Δλ=15 nm，扫描同步荧光光谱。
2 结果与讨论
2.1 猝灭类型的确定
2.1.1 BSA荧光光谱的变化 固定BSA的量，向其中加入磷钨酸溶液。随着浓度的增加，BSA的荧光强度逐渐降低，证明磷钨杂多酸和BSA之间存在相互作用，产生了猝灭现象（图1）。
2.1.2 温度对荧光猝灭的影响 药物分子对蛋白质的荧光猝灭可分为能量转移猝灭、静态猝灭与动态猝灭[3]。能量转移猝灭的结果，通常使受体的荧光光敏化增强，在实验中容易观察。因此需要区别的是动态猝灭和静态猝灭。动态猝灭为荧光体处于激发态时与猝灭剂引起的猝灭，由分子扩散和碰撞引起。静态猝灭作用是指荧光体与猝灭剂之间借助分子间力，彼此结合形成不发光的复合物从而导致荧光体荧光强度减弱的现象。一般来说，动态猝灭过程应遵循Stern-Volmer方程式[4]：F0/F=1+KA[Q]=1+Kqτ0[Q]。其中，F和F0分别代表加入与不加入猝灭剂时体系的相对荧光强度；[Q]是猝灭剂的浓度；KA与Kq分别为动态猝灭常数与荧光猝灭速率常数；τ0是没有猝灭剂存在时，荧光物质的平均寿命（τ0约为10-8 s）。本实验分别测定了在298K和310K时磷钨杂多酸与BSA相互作用的荧光光谱。根据Stern-Volmer方程绘制不同温度下F0/F-1～[Q]图（图2），表1为不同温度下磷钨杂多酸与BSA荧光猝灭的Stern-Volmer方程及猝灭常数。动态猝灭主要依赖于扩散效应，温度升高导致扩散速度加快，KA将随着温度的升高而增大，而从图2和表1都可以看出，随着温度的升高，直线斜率逐渐减小，故磷钨杂多酸对BSA的猝灭过程不是动态猝灭，而是静态猝灭。
2.2 热力学参数的计算和作用类型的推断
猝灭剂和白蛋白相互作用力包括范德华力、氢键力、疏水作用力和静电力。因为温度对反应的结合常数影响比较小，所以当温度变化范围不大时可以近似认为反应焓变为一常数，因此，根据热力学方程可知：ln（K2/K1）=ΔH/R（1/T1-1/T2），ΔG=-RTlnK，ΔG=ΔH-TΔS。用表1中的KA值计算热力学焓变ΔH、熵变ΔS和自由能变ΔG，其结果见表2。由表2可知，ΔG
2.3 BSA紫外吸收光谱的变化
本研究分别测定了pH7.4的条件下，BSA的紫外吸收曲线及磷钨杂多酸与BSA等摩尔混合物与磷钨杂多酸的差谱。由图3可知，磷钨杂多酸与BSA等摩尔混合物与BSA的紫外吸收光谱未完全重合，证明磷钨杂多酸与BSA的猝灭机制为静态猝灭。
2.4 结合位点数的计算
假设一个BSA分子有n个相互独立的结合位点可与磷钨杂多酸结合，则根据logKA+nlog[Q]=log（F0/F-1）分别作不同温度下log（F0/F-1）～log[Q]的对数图（图4），根据斜率可求得298K和310K时BSA对磷钨杂多酸的结合位点数分别为1.0和1.2，从而推测磷钨杂多酸与牛血清蛋白二者均为1∶1结合[6]。
2.5 结合常数的计算
对于1∶1结合的静态猝灭，磷钨杂多酸与BSA的结合常数可以根据Lineweaver-Burk方程求得：（F0-F）-1=F0-1+（KLBF0）-1[Q]-1。根据此方程，以（F0-F）-1对[Q]-1作图，可以求得不同温度下的KLB（表1）。
2.6 猝灭机制的确定
通过温度对猝灭的影响和BSA紫外吸收光谱的变化这两种方法的综合考察，可以确定，磷钨杂多酸与BSA相互作用的机制主要为静态猝灭。
2.7 BSA同步荧光光谱的测定
保持Δλ=60 nm，作BSA的同步荧光光谱，此时同步荧光光谱仅表现出色氨酸的荧光。保持Δλ=15 nm，作BSA的同步荧光光谱，此时同步荧光光谱仅表现出酪氨酸的荧光[7]。固定BSA的量，逐渐增加磷钨杂多酸的加入量，两者的荧光强度均下降，而色氨酸的下降幅度更大，说明磷钨杂多酸与BSA的结合位点更接近于色氨酸。两者的最大发射波长没有明显变化，证明磷钨杂多酸与BSA发生了相互作用，但是并没有改变蛋白的构象。
3 小结
本文研究了磷钨杂多酸与BSA之间的作用机制，结合温度对荧光猝灭的影响与BSA紫外吸收光谱的变化，确定磷钨杂多酸与BSA相互作用的机制主要为静态猝灭。通过BSA同步荧光光谱的测定，证明磷钨杂多酸与BSA发生了相互作用，但是并没有改变蛋白的构象，为后续多酸药物的研发提了供理论依据。
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牛血清白蛋白范文第6篇
[关键词] 牛血清白蛋白；生物色谱柱；阿司匹林
[中图分类号] R96[文献标识码] B[文章编号] 1673-7210（2014）06（a）-0101-04
Preparation of bovine serum albumin biological chromatographic column and its application in determination of Aspirin
TANG Lingli1 WEI Shibai2 HUANG Dongping1 HUANG Mingli1 RUAN Chong1
1.College of Public Health of Guangxi Medical University, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China; 2.Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China
[Abstract] Objective To prepare biological chromatographic column to separate and determine the ingredients of drugs. Methods Silica gel was reacted with 3-aminopropyl trimethoxylsilane to form amine functionalized activated silica gel, which was covalent binding with BSA to synthesize BSA bonded stationary phase. Then BSA bonded stationary phase was packed column with homogenization, thus BSA biological chromatographic column was prepared. Aspirin was taken as a detective object to examine the combination performance and separation performance of BSA bonded stationary phase. Results It came to that, the combined rate was 3.69 μmol/g, the biological chromatographic column was 74 mg/g, the amount of Aspirin in per tablet was 14.65 μg and the labeled amount was 107.8% detected by BSA biological chromatographic column. Conclusion All of above shows that BSA bonded stationary phase is synthesized successfully, and the BSA biological chromatographic column has good combination property and separation property.
[Key words] Bovine serum albumin; Biological chromatographic column; Aspirin
牛血清白蛋白色谱柱的制备
及对阿司匹林的
1.广西医科大学公共卫生学院，广西南宁 530021；2.广西医科大学第一附属医院药学部，广西南宁 530021
[摘要] 目的 制备生物色谱柱，用于分离或测定药物成分。 方法 采用3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTS）与硅胶反应生成氨基功能化的活化硅胶，并与牛血清蛋白（BSA）共价结合形成BSA键合固定相，匀浆装柱制备成BSA生物色谱柱，以阿司匹林（Aspirin，ASP）为分析对象考察BSA固定相的结合性能和分离性能。 结果 BSA结合率为3.69 μmol/g，ASP在BSA键合固定相色谱柱上的最大结合量为74 mg/g，经BSA色谱柱测得阿司匹林肠溶片的含量为14.65 μg/片，标示量为107.8%。 结论 这表明BSA与硅胶载体成功结合形成BSA键合固定相，所制备的BSA生物色谱柱具有良好的结合性能与分离性能。
[关键词] 牛血清白蛋白；生物色谱柱；阿司匹林
[中图分类号] R96[文献标识码] B[文章编号] 1673-7210（2014）06（a）-0101-04
Preparation of bovine serum albumin biological chromatographic column and its application in determination of Aspirin
TANG Lingli1 WEI Shibai2 HUANG Dongping1 HUANG Mingli1 RUAN Chong1
1.College of Public Health of Guangxi Medical University, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China; 2.Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China
[Abstract] Objective To prepare biological chromatographic column to separate and determine the ingredients of drugs. Methods Silica gel was reacted with 3-aminopropyl trimethoxylsilane to form amine functionalized activated silica gel, which was covalent binding with BSA to synthesize BSA bonded stationary phase. Then BSA bonded stationary phase was packed column with homogenization, thus BSA biological chromatographic column was prepared. Aspirin was taken as a detective object to examine the combination performance and separation performance of BSA bonded stationary phase. Results It came to that, the combined rate was 3.69 μmol/g, the biological chromatographic column was 74 mg/g, the amount of Aspirin in per tablet was 14.65 μg and the labeled amount was 107.8% detected by BSA biological chromatographic column. Conclusion All of above shows that BSA bonded stationary phase is synthesized successfully, and the BSA biological chromatographic column has good combination property and separation property.
[Key words] Bovine serum albumin; Biological chromatographic column; Aspirin分子生物色谱法（MBC）是20世纪80年代中后期逐渐发展起来的以酶、受体、抗体、传输蛋白等生物大分子为固定相的一类色谱法，是基于生物大分子的特异性相互作用原理进行分离纯化具有活性的化合物或测定生化参数的一项新兴技术[1]。药物作为一类重要的生物活性物质与血浆蛋白存在可逆性的结合平衡，药物分子通过血浆白蛋白的运输到达受体部位发生药理作用，而药物分子在体内与血浆蛋白的相互作用是其发挥药理作用的前提，因此可以通过血浆白蛋白生物色谱筛选药物中的活性成分。付强等[2]通过自制人血清白蛋白色谱柱成功对DL（±）色氨酸进行了手性分离；Bentucci等[3]制备出的血清白蛋白色谱柱，不仅可筛选出药物活性成分，还可通过体外实验反映药物-血清白蛋白的相互作用。蔡汉宁等[4]制备出核心组蛋白色谱柱作用于其活性物质，至少筛选出9种组蛋白作用蛋白。与传统的实验方法相比，分子生物色谱法具有高度专一性、分离速度更快、容易自动化操作、重复性好等优点[5]。
由于人血清白蛋白价格昂贵，用于制备生物色谱柱成本太高，有学者利用牛血清白蛋白与人血清白蛋白结构相似的特点，制备成牛血清白蛋白色谱柱用于中药活性成分的分离测定。Tan等[6]通过制备的牛血清蛋白生物整体柱，成功的分离出当归的活性成分，并考察了当归提取液在该整体柱上保留的影响。本文主要通过将硅胶氨基功能化与BSA共价键结合合成BSA固定相，制备BSA生物色谱柱，并选择了阿司匹林（ASP）作为与BSA结合的对象来验证BSA色谱柱的性能。ASP作为一种代表性药物，不仅具有卓越的消炎、退热、止痛能力，研究表明它还可以协同干扰素抑制肝细胞癌生长转移[7]，抑制宫颈癌Hela细胞增殖[8]，预防妊娠期高血压[9]等。通过对ASP及其肠溶片的分离测定，可以进一步探讨生物色谱柱在药物有效成分分离测定中的应用前景。
1 仪器与材料
6010紫外可见分光度计（安捷伦科技公司，上海）；LC-10Tvp高效液相色谱仪（日本岛津公司）；spectrum 100傅立叶变换红外光谱仪（美国penkim Elmer仪器有限公司）；Bio-Rad垂直电泳槽、电泳仪（美国Bio-Rad公司）。
3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTS）（97%，上海晶纯试剂有限公司，批号：15122）；N，N′-琥珀酰亚胺碳酸酯（98%，阿拉丁公司，批号：25231）；考马斯亮蓝G250（沃凯，批号：WB20091102）；BSA（Solarbio）；硅胶Sepra Silica （粒径50 μm，phenomenex 美国）；ASP标准品（Purity>99%）；ASP肠溶片（50 mg/片，国药准字H43021814）；四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺溶液、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺、Tris碱、甘氨酸、十二烷基硫酸钠（SDS）均来自北京索莱宝。
2 方法与结果
2.1 BSA色谱柱的制备
取硅胶2 g（平均粒径为50 μm，孔径46 Å（1 Å=0.1 nm），比表面积为518 m2/g），加入适量甲苯回流除去残留水分，按10 μmol/m2加入3-氨丙基三甲基硅烷反应8 h得到氨丙基硅胶，过滤，分别用甲苯和甲醇洗涤，真空干燥后置干燥器保存。取氨丙基硅胶2 g，加入乙腈5 mL和N，N′-琥珀酰亚胺碳酸酯2 g，于30℃反应24 h，过滤后分别用乙腈、甲醇洗涤得到活化硅胶。取制备得的活性硅胶1.5 g，加入到25 mmol/L（pH=6.6）的磷酸盐缓冲液中，再加入适量BSA，30℃下搅拌反应20 h，过滤后依次用水及5%乙醇多次洗涤，得到BSA固定相。将制备好的BSA固定相用缓冲液匀浆后注入不锈钢柱（4.5 nm×150 nm）中，并抽真空压紧柱，制备得到BSA色谱柱。
2.2 傅里叶红外光谱（FTIR）验证活化硅胶功能基团
用溴化钾压片法制备活化硅胶样品，进行FTIR分析。FTIR分析结果见图1，硅胶（a）和活化硅胶（b）共有的吸收峰有：1099、1103 cm-1处的非对称伸缩振动，指纹区800 cm-1的对称伸缩振动和470 cm-1的弯曲振动，均为硅胶的主要结构Si-O的特征谱带；与硅胶（a）相比，活化硅胶（b）增加了伯胺（-NH2）的吸收峰1402、1561 cm-1，2928 cm-1峰为亚甲基的不对称变形振动峰，说明硅胶上中有亚甲基的存在，表明APTS已结合在硅胶上。由此可见，活化硅胶成功连接上了氨基功能基团。
a.硅胶；b.活化硅胶
图1 硅胶和活化硅胶的红外光谱图
2.3 BSA与活化硅胶结合量
按硅胶与BSA质量比8∶1、4∶1、2∶1、1∶1进行表面覆盖率的测定。称取四份硅胶，每份0.5000 g，分别与0.0625、0.1251、0.2500、0.5000 g BSA反应，反应结束后各取100 μL洗涤液采用考马斯亮蓝染色法[10]测定其中BSA含量，用BSA加入量与反应剩余BSA量之差计算出结合量，按照下列公式计算出BSA的表面覆盖率：表面覆盖率=结合蛋白的物质的量（μmol）/活化硅胶质量（g）。结果显示，活化硅胶与BSA质量比为4∶1时，BSA结合量已基本达到饱和，加大剂量并不能明显的增加键合量，表明BSA表面覆盖率可能受空间位阻大小的影响。见图2。
图2 活化硅胶与BSA不同配比下的BSA表面覆盖率
2.4 BSA固定相结合ASP研究
精密称取ASP对照品50 mg，用冰醋酸-甲醇（1∶10）溶液稀释至50 mL，摇匀，得到ASP标准溶液。取ASP标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL用冰醋酸-甲醇（1∶10）溶液稀释至10 mL，各取10 μL用于HPLC。色谱条件：流动相：甲醇-20%冰醋酸（3∶1）；流速：1 mL/min；色谱柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30℃；紫外检测器，λ=237 nm。得到ASP标准曲线方程：Y = 97 941X+ 37 178，r = 0.9997，其中Y为峰面积，X为ASP浓度（μg/μL）。
称取一定量的硅胶和BSA固定相匀浆法分别填装于两根柱子中，精密称定适量的ASP，用中性乙醇溶解后缓缓倾注入色谱柱中，用蒸馏水洗涤柱子，接收洗涤液，根据标准曲线计算洗脱液中ASP含量，ASP加入量与洗脱液中ASP含量之差得到固定相对ASP的结合量，见图3。对比硅胶固定相和BSA固定相对ASP的结合量，ASP与BSA固定相结合量明显大于与硅胶固定相结合量，证明与ASP结合的主要是BSA而不是硅胶。
图3 硅胶固定相、BSA固定相与阿司匹林结合量的比较
2.5 BSA色谱柱性能考察
2.5.1 BSA固定相的pH值稳定性分别配制pH=4.5、6.5、7.5、8.0的KH2PO4-K2HPO4溶液（25 mmol/L），用上述四种缓冲液各10 mL分别洗脱BSA色谱柱，接收洗脱液，测定洗脱液中BSA含量，考察BSA固定相在不同pH值缓冲液中的稳定性。
牛血清白蛋白范文第7篇
关键词 磁金纳米粒子； 牛血清白蛋白； 结合常数； 荧光光谱
1 引 言
磁金纳米粒子是兼有磁纳米粒子和金纳米粒子优点的复合纳米材料，金包覆的磁纳米粒子（Fe3O4/Au）在水相中分散良好，不易受酸碱腐蚀，在常温下表现出良好的顺磁性，并具有稳定的光学吸收特点，适用于传感器、生物医学等领域 ＼[1，2]。其金表面可以通过静电作用直接与抗体、细胞以及DNA等生物活性分子连接，且有利于保持生物活性。Fe3O4/Au复合粒子的超顺磁性也为样品的分离、富集、固定等提供了方便，是一种理想的载体。
血清白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质[3]。该蛋白质的表面具有多个亲脂性的结合位点，可以与疏水性物质结合，如药物，尤其是具有中性和负电荷亲脂性的化合物[4]。蛋白质和药物的相互作用大大影响药物的生物活性，在药物的药代动力学和药效学中起重要作用[5]。在药物与白蛋白的结合中，非共价的分子间相互作用是主要的结合模式。为了研究非共价分子间相互作用，已经建立了一些方法以计算出结合常数，包括荧光光谱法[6]、毛细管电泳法[7]、色谱法[8]、表面等离子体共振（SPR）[9]、质谱（MS）[10]等。在这些方法中，荧光光谱法和电喷雾电离（ESI）质谱被广泛应用于定量研究。
牛蒡子是植物牛蒡（Arctiin lappa L.）的果实，是一种中草药，其主要活性成分是牛蒡子苷。牛蒡子具有疏散风热，宣肺透疹，消肿解毒，抗胰腺癌等活性[11，12]。
本实验首先合成了Fe3O4/Au纳米粒子，并通过紫外吸收光谱和扫描电镜对其进行表征。由于Fe3O4/Au纳米粒子的超顺磁性和生物相容性，将其作为牛血清白蛋白的载体。在外加磁场的作用下，Fe3O4/Au纳米粒子白蛋白药物复合物与游离药物分离，使非共价结合的白蛋白和药物均从样品溶液中分离出来，消除了药物测定时白蛋白的影响。白蛋白结合在Fe3O4/Au纳米粒子上的量可通过荧光光谱测定在溶液中白蛋白的残余量得到。与白蛋白结合的药物量可以通过荧光光谱测定样品溶液中游离药物的浓度得到。分别测定白蛋白和药物，使二者相互之间没有干扰。基于药物的浓度和白蛋白的量，通过Scatchard方程直接计算得到非共价复合物的结合常数和结合位点数。
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牛血清白蛋白范文第8篇
[关键词] 荧光光谱法；分光光度法；盐酸拓扑替康；盐酸依利替康；喜树碱类药物；牛血清白蛋白；结合反应
喜树碱是采用特殊工艺从植物中提取而得的，来源于我国特有珙桐科植物喜树，是一种具有很强抗癌活性的天然化合物[1]。蛋白质是最重要的生物大分子之一，几乎参与了所有生命活动过程。本研究采用荧光光谱法、分光光度法对蛋白质与盐酸拓扑替康（THC）与盐酸依利替康（IHC）两种喜树碱类药物有机小分子的相互作用机理进行研究，为高效低毒的喜树碱类药物开发提供参考。
1 实验方法
1.1检验设备
CARY Eclipse型荧光光度计（瓦里安）；3400型uv—vjs分光光度计（日立）。
1.2实验方法
1.2.1荧光光谱法[2]
在10ml比色管中加入0.2ml牛血清白蛋白（含量lmg/ml），依次加入1×10-4mol/l盐酸拓扑替康溶液适量，0.5mlPH为7.4的Tris-HCl缓冲溶液，用荧光光度计以1cm石英比色皿测定荧光强度。然后分别加入KCl、CaCL2、ZnCl2、FeCL3、CuCl2溶液测定金属离子对喜树碱类药物猝灭BsA荧光的影响.
1.2.2分光光度法[3]
在10ml比色管中加入lml1×10-4mol/l盐酸拓扑替康溶液，加入0.5mlPH为7.4的Tris-HCl缓冲溶液，在分光光度计上进行吸光度测定。盐酸依利替康测定方法同上。
2 结果
2.1荧光光谱
牛血清自蛋白分子中因含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等残基而发射较强的内源荧光。用盐酸拓扑替康与盐酸依利替康两种喜树碱类药物滴定牛血清自蛋白，测定结果显示350nm处的荧光发射峰被猝灭，而在450nm、540nm二处出现了新的发射峰，即盐酸拓扑替康与盐酸依利替康的发射峰，二种分子在405nm处有一等发射点，荧光光谱结果提示牛血清自蛋白与盐酸拓扑替康与盐酸依利替康之间发生了静态猝灭作用，二者结合生成了超分子化合物，405nm处的等发射点说明溶液中同时存在着被结合的和游离的盐酸拓扑替康与盐酸依利替康，从荧光光谱图中显示，仅盐酸拓扑替康与盐酸依利替康比有牛血清自蛋白存在下盐酸拓扑替康与盐酸依利替康的最大吸收峰强度要弱，充分说明牛血清自蛋白与盐酸拓扑替康与盐酸依利替康之间发生了非辐射荧光共振能量转移，且牛血清自蛋白对盐酸拓扑替康与盐酸依利替康的荧光吸收有敏化作用。
2.2分光光度
牛血清自蛋白加入盐酸拓扑替康与盐酸依利替康的紫外可见吸收光谱。随着盐酸拓扑替康与盐酸依利替康的加入，在278nm处的牛血清自蛋白吸收峰逐渐升高并伴有轻微的蓝移，结果与荧光光谱相符，结果提示牛血清自蛋白与盐酸拓扑替康与盐酸依利替康相互作用引起了蛋白质分子发生了变化，短波方向移动说明蛋白质分子的肽链延伸了并且疏水性下降。
3 讨论
人血清白蛋白（HSA）与牛血清白蛋白（BSA）具有相似的氨基酸序列，人血清白蛋白是由585个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质，分子量为67kDa；而牛血清白蛋白是由580个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质，分子量为68kDa。肽链中都含有35个半胱氨酸残基。因此，在药物研究中，牛血清白蛋白常替代人血清白蛋白来作为蛋白质模型进行体外研究，作为与人血清白蛋白结合情况的参考，且价廉易得，而人血清白蛋白主要用于遗传方面、临床、新陈代谢的研究。
本研究采用荧光光谱法、分光光度法研究盐酸拓扑替康与盐酸依利替康两种喜树碱类药物与牛血清白蛋白的相互结台反应结果显示，牛血清自蛋白与盐酸拓扑替康与盐酸依利替康之间发生了静态猝灭作用，二者结合生成了超分子化合物。牛血清白蛋白与二种喜树碱类药物之间存在的相关性，可引起了蛋白质分子的变化。
参考文献：
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牛血清白蛋白范文第9篇
关键词 鲤鱼；血清白蛋白；提取工艺；等电点沉淀法 ；盐析法；优化法
中图分类号 TQ464.7 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）15-0286-01
血清白蛋白是脊椎动物血浆中含量最丰富且极易纯化的蛋白质，是血液系统的重要组分，具有结合和运输内源性及外源性物质，维持血液胶体渗透压，清除自由基，抑制血小板和抗凝血以及影响动脉血管的渗透性等生理功能。在过去的30年中，它以其特有的地位成为物理学家、化学家和生物学家研究的一种典型的、理想的蛋白质，它也是血浆蛋白中研究的最早和最清楚的组分。人血清白蛋白（human serum album，HSA）及牛血清白蛋白（bovine serum album，BSA）的部分氨基酸序列于1975 年即已得到，1982年得到HSA 的cDNA 全序列。随后，对其他多种动物的血清白蛋白的研究工作也相继展开，如爪蟾血清白蛋白，鲑鱼血清白蛋白等。鱼类是最古老的脊椎动物，相对于大量的牛血清白蛋白、人血清白蛋白研究文献，鱼血清白蛋白的提取工艺文献尚未见报道[1-2]。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验用鱼为鲤鱼，体重1 kg左右，由实验室购买。试验鱼先在室内水族箱暂养3 d，暂养用水为实验室的自来水，期间用气泵进行增氧，暂养期间不喂料。试验容器为方形塑料水箱。试验用水为充分曝气24 d以上的自来水，水温变化范围10～12 ℃，pH值为7.5～8.0，DO值保持在5 mg/L。试验药物使用前，取2个水族箱装满水提前曝气3 d以备试验使用。
1.2 主要试剂与仪器设备
试剂：饱和硫酸铵、1 mol/L盐酸、抗凝剂、奈氏试剂。仪器设备：容量瓶、透析袋、pH计、数显恒温水浴锅、高速冷冻离心机、电炉或加热板、抽滤泵、分析天平等。
1.3 试验方法
1.3.1 血清的制备。鲤鱼的血液从尾静脉中采取，方法是首先用针管吸入少许抗凝剂，然后沿侧线刺入，针头刺到椎骨位置后斜插入椎体腹侧，尾静脉血液顺势流入针管，每尾鱼可用此方法数次采血，但每次针头插入部位应在前次插入部位之前。放入用抗凝剂润洗过的带盖塑料离心管中，加柠檬酸钠抗凝，室温静置3 h，再以3 000 r/min离心15 min，取上清于-20 ℃冰箱冷冻，备用。
1.3.2 等电点沉淀法。将已制备好的冷冻鱼血清解冻，用移液枪吸取上清（血清）1 mL至2 mL离心管，将血清用1 mol/L盐酸溶液调pH值，当pH计显示到4.6～4.9后，静置2 h后将离心管放入高速冷冻离心机，于4 ℃以3 500 r/min离心15 min，取离心后沉淀溶于1 mL蒸馏水中，将溶液装于透析袋中，放入pH值为7.4的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无NH4+存在。NH4+的检测：取1 mL透析液，加入5滴奈氏试剂，混匀，如果出现砖红色沉淀，说明仍有NH4+存在，需继续透析。
1.3.3 盐析沉淀法。用移液枪吸取上清（血清）1 mL至10 mL离心管，量筒量取9 mL底液，用移液管逐滴加入，在加的过程中需不断摇晃或振荡，4 ℃静置2 h后离心，于4 ℃以3 500 r/min离心15 min，收集上清，用1 mol/L盐酸调节pH值至4.5，用量筒确定上清液的体积，计算加入饱和硫酸铵（pH=4.5）的体积（0.11×V），逐滴加入饱和硫酸铵（pH=4.5），边加边振荡，4 ℃静置2 h后离心。4 ℃，3 000 r/min离心20 min，弃上清，沉淀用0.5 mL pH=7.4的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液溶解。将剩余的0.4 mL蛋白质溶液加入透析袋中，放入pH=7.4的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无NH4+存在。
1.3.4 优化法。取上清液0.5 mL，向其中加硫酸铵0.5 mL至50%饱和度放置2 h以上，2.4 ℃，3 500 r/min离心15 min后取上清液。上清液用1 mol/L的HCl溶液调pH值至4.0，放置2 h以上，4 ℃，3 500 r/min离心15 min取沉淀。用与库浆等体积的水溶解沉淀，加辛酸钠至浓度为1 mg/L。调pH值至6.4～6.5，70 ℃水浴保温30 min。冷却后加硫酸铵到45%饱和度放置2 h以上，3 500 r/min离心15 min取上清。上清液调pH值到4.0放2 h以上，3 500 r/min离心15 min取沉淀。除盐：将剩余的蛋白质溶液放透析袋中，放入pH值为7.4的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无NH4+存在[3-4]。
2 结果与分析
等电点沉淀法、盐析沉淀法、优化法3种提取工艺1 mL血清提取的白蛋白分别为0.253 8、0.381 5、0.504 8 mg。
蛋白质的溶解度与溶液的pH值有关，通常在溶液的pH值等于某蛋白质的pI值时，该蛋白质的溶解度最小。可是，大幅度改变蛋白质溶液的pH值，极有可能会导致蛋白质变性的危险，于是产生了另一沉淀法，即盐析法。其原理是蛋白质、酶在低盐浓度下的溶解质随着盐液浓度升高而增加，称为蛋白质的盐溶；当盐浓度不断上升时，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。盐析法就根据不同蛋白质和酶在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。
试验过程中使用的硫酸铵盐析沉淀法和等电点沉淀法提取工艺产量还不够多，并且产品纯度也不够理想，而且某些步骤尚有改进的必要，血清白蛋白在体内有运载脂肪酸的作用，并且它结合脂肪酸后热变性温度升高，不同的脂肪酸影响程度不同，血清中加入脂肪酸盐进行加热处理可使杂蛋白变性沉淀，因此选用脂肪酸盐为保护剂，结合盐析法和等电点沉淀法的优点，对分离纯化工艺进行了改进，提高了血清白蛋白的质量和纯度[5-6]。
3 结论
通过试验结果得出，等电点沉淀法所提取的鱼血清白蛋白量最少，其次是盐析法提取鱼血清白蛋白，提取量最多并且纯度最高的是通过等电点沉淀法和盐析法改进的优化法。
4 参考文献
[1] 徐云远，葛瑞昌，周桂花.牛血清白蛋白纯化工艺的改进[J].甘肃科学报，1991（1）：51-54.
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[4] 季钟煜.从极度溶血的牛血中制取牛血清白蛋白[J].生命的化学，1990，10（3）：35-36.
[5] 王世中.用中性盐分离和提纯蛋白质[J].生物化学与生物物理进展，1989（6）：62-63.
牛血清白蛋白范文第10篇
关键词：水杨醛对硝基苯甲酰腙席夫碱；铜（Ⅱ）；水杨醛对硝基苯甲酰腙席夫碱合铜（Ⅱ）配合物；合成；生物活性
中图分类号：O614.121 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）19-4642-03
席夫碱及其金属配合物具有较好的抑菌、抗癌和抗病等药理性质[1]。近年来，席夫碱及其金属配合物被广泛应用于生物医学、催化、材料等领域，成为配位化学研究的热点[2]。酰腙类化合物因其含有
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
1.2 方法
2.3 生物活性分析
试验结果表明，在大肠杆菌中抑菌圈直径7 mm，在金黄色葡萄球菌中抑菌圈直径13 mm。配合物对这两种不同细菌均表现出了一定的抑制性，对金黄色葡萄球菌表现出了更好的抑菌活性。
2.4 配合物对蛋白质的相互作用分析
由图4可知，配合物与牛血清白蛋白溶液混合后的荧光发射光谱峰均发生了蓝移，且对牛血清白蛋白溶液均有荧光猝灭作用。随着配合物浓度的增加，对牛血清白蛋白溶液的荧光猝灭作用增强。说明配合物对牛血清白蛋白溶液有荧光猝灭作用[13]。
3 小结与讨论
。
2）通过研究配合物的抑菌活性发现所合成的配合物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均表现出了一定的抑制作用，且对金黄色葡萄球菌表现出了更好的抑菌活性。
3）配合物对牛血清白蛋白溶液有荧光猝灭作用，随着配合物加入量的增加，对牛血清白蛋白溶液的荧光猝灭作用增强。
本研究对水杨醛对硝基苯甲酰腙席夫碱合铜（Ⅱ）配合物的合成与性质研究提供了一定的试验依据，但对配合物的抑菌机理以及与牛血清白蛋白溶液的作用机理还有待进一步研究。
参考文献：
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